培養基板の微細形状設計によるiPS細胞の分化誘導評価

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25930025
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 井上 諭 長崎大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 社会人大学院生
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: iPS / 分化 / 培養基材

Research Abstract

【研究目的】培養機材の微細茎状設計によって、iPS細胞の接着形態や自己分泌サイトカインなどを制御する技術を確立するとともに、分化の方向性の違いを評価する。
【研究方法】
1. iPS細胞(201B7)の継代 : フィーダー細胞(SNL76/7)を用い、未分化を維持したままiPS細胞を培養。
2. 直径0.5㎛、2.0㎛、高さ2.0㎛のナノピラー培養基材を準備。(材質はPDMS、ポリスチレンの2種類)
3. iPS細胞の分化誘導 : iPS細胞から極力フィーダー細胞を除去。ピペッティングや酵素処理でiPS細胞をsingle cellとし、液性因子を添加していない基礎培地を用いてLaminin-5でコーティングした培養基板(平面、直径0.5㎛、2.0㎛の3種類をそれぞれPDMSとポリスチレンの2種類の材質、計6種類)に播種。
5. 培養基板の微細形状設計が及ぼす、iPS細胞の分化の方向性の違いをリアルタイムPCRにより評価する
【研究成果】まずiPS細胞をsingle cellにし、培養基材に接着させた後に、single cellのまま培養を続けることが非常に困難で、実験が安定せず、必要量の細胞を確保できないなどの問題が発生した。播種密度を増やし、細胞量を確保すると、基材に接着したのちに直ぐにcolonyになり、一つの細胞にかかる力を調整することは困難で、本実験の目的を果たすことは出来なかった。また、回収したcolonyをリアルタイムPCRにかけ分化の方向性を評価したところ、基材の違いにより確かに遺伝子発現に差が出ることは確認できたが、細胞のlot、継代数の違いで発現する遺伝子に差があり、再現性は認められず、有意な結果は得られなかった。
培養基材の違い、細胞にかかる外力の違いで分化方向に差がでる可能性は非常に高いと考えるが、本実験を行うには細胞1つにかかる力を均衡にする必要があり、まずはiPS細胞をcolonyではなくsingle cellの状態で培養し得る技術が必要だったが、実験中はそれをなし得なかった。
colonyのまま培養し、さまざまな細胞株で分化方向に差がみられるかの検討も試みたが、研究代表者の異動により、実験は行えず、本実験は終了した。