新規ハイブリダイゼーションプローブを用いたC型肝炎ウイルス遺伝子型解析系の構築

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25931019
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 栗原 真希子 東京大学, 医学部附属病院, 臨床検査技師
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: C型肝炎ウイルス遺伝子型 / Eprobe

Research Abstract

C型肝炎のインターフェロン治療を開始する際にはC型肝炎ウイルスの遺伝子型を特定することが必須である。しかし、当院の現行法であるダイレクトシークエンス法や市販のキットを用いたPCR法は感度や特異度に問題があり、重複感染症例における遺伝子型の特定は困難である。そこで、上記二法の問題点を解決するため、新規蛍光ハイブリダイゼーションプローブ(以下Eprobe)を用いた解析系を構築することを目指した。
まず、1a型、1b型、2a型、2b型、4型の各遺伝子型に特異的に結合する5種類のEprobeの設計を行い、LightCyclerを用いた測定系の条件検討を行った。当初はPCR増幅産物を分注したところにEprobcを加え融解曲線解析を行う予定であったが、この方法では検出感度が低かったため、PCR増幅時からEprobeを加えることとした。その結果使用するサンプル量は増えるものの感度が良くなり、EprobcがLightCyclerを用いた測定系で使用可能であることが確認された。
解析条件の決定後、現行法にて遺伝子型確定済の臨床サンプルを用いて解析を行った。その結果、1b型検出用Eprobeは現行法で1b型と判定されたサンプル47例中45例(95.70%)で1b型と判定できた。残りの2例は予想された融解曲線とは異なる温度のピークを示したが、これはプローブ結合部位の一塩基置換によるものであることがシークエンス解析により判明した。また、1a型は2例中2例、2a型は13例中12例、4型は3例中3例で現行法と一致したが、いずれもサンプル数が少なくさらなる検討が必要と考えられる。一方、2b型検出用Eprobeの検討では予想していたものと異なるピークが検出され判定不能であったため、プローブの再設計が必要である。
現在までの研究では、目的としていたすべての遺伝子型に対応した解析系を構築することはできなかったが、Eprobeを用いた解析は簡便で迅速な方法であることが確認され有用であると考えられた。今後も解析系の構築を目指し検討を続けていきたい。