2014 Fiscal Year Annual Research Report
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26242068
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
藤井 宣晴 首都大学東京, その他の研究科, 教授 (40509296)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
眞鍋 康子 首都大学東京, その他の研究科, 准教授 (60467412)
中川 嘉 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 准教授 (80361351)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | マイオカイン / 骨格筋 / 分泌 / 筋収縮 / 構成性分泌 / 調節性分泌 / 筋サテライト細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度はマイオカインの網羅的探索を行った。まず、筋サテライト細胞の初代培養系を構築した。次に、初代培養した筋管細胞を、電気収縮装置で1 時間収縮させた。収縮させた細胞とコントロール細胞の培養液に含まれるタンパク質をショットガン・プロテオーム解析で同定した。前者には構成性に分泌されるマイオカインと筋収縮によって調節性に分泌されるマイオカインが混在していることになる。一方、後者には構成性に分泌されるマイオカインのみが含まれることになる。それらの引き算によって、筋収縮に反応して分泌されたマイオカインを推定した。さらに、筋収縮によって発現量が変化する骨格筋細胞の遺伝子を、DNAマイクロアレイ法で同定した。上記2つの方法で得られたデータをタンパク質の構造予測解析に供し、分泌タンパク質を予測した。すなわち、シグナル・ペプチドを有し（SignalP; http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）、膜貫通領域（疎水領）が1 カ所以下で（SOSUI; http://bp nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui）、核・ミトコンドリア・小胞体への局在配列を持たない分子（SORT; http://psort.hgc.jp/）を、解析対象とした。その結果、分泌タンパク質と推定された分子に関しては、骨格筋組織および初代培養筋細胞から抽出したmRNAを用いて、RT-PCR 法で発現を再確認した。その結果、約40個のタンパク質が、マイオカインの候補分子として同定された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度は、骨格筋細胞から分泌されるマイオカインを網羅的に探索することを目的とした。まず第一に、筋サテライト細胞の初代培養系を成功裏に確立できた。さらにそれを電気刺激による収縮実験に応用することにも成功した。これらによって、これまでは株化した細胞（マウス由来C2C12細胞）しか用いることができなかった状況が改善され、より生体に近い状態の細胞（初代培養細胞）を用いることが可能となった。さらに、プロテオーム解析とDNAマイクロアレイ解析の2つの方法で広範なスクリーニングを行った。いずれの方法においても、数度のフィードバックによる実験系精度の向上を行った。その結果、最終的に約40個の候補分子を同定できた。得られた候補の数は、以降の解析に供するのに十分であると判断される。これらの理由から、平成26年度の研究目的は、ほぼ全て達成されたと結論できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度は、平成26年度に同定されたマイオカイン候補の中から、より重要な働きをするものを見極めて、解析対象を絞り込みことにする。ショウジョウバエを用いた機能スクリーニングを行う。ショウジョウバエは遺伝子変異体のデータ蓄積が豊富で、かつ寿命が短いため一生の観察を短期間で行える利点を持つ。遺伝子組み換え系統の制作および維持費も安価である。そこで、ショウジョウバエの骨格筋特異的に、同定したマイオカイン候補分子をノックダウンした系統を作製し、その表現系の変化を指標に絞込みを行う。作製にはGAL4/UAS システムを利用する。まず、標的となるマイオカインのRNAi を転写活性化因子GAL4 の結合配列であるUAS 下に組み込んだ遺伝子組み換え体系統を、ショウジョウバエ・ストックセンター（Vienna Drosophila RNAi Center）から購入する。購入したハエを、24B プロモーターで骨格筋特異的にGAL4 を発現させた系統と交配させることにより、骨格筋特異的なノックダウンが可能となる。観察する表現型は、寿命、自発的活動量、自発的活動量の概日リズム、運動能力、体重等とし、特に寿命に注目する。ショウジョウバエの遺伝子工学は、専門家6)の坂井貴臣博士（首都大学東京・理工学研究科）の助言を受けながら進める。
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