CRISPRを利用したエピゲノムの読み出しと書き込み

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26250038
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 伊藤 隆司 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90201326)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: エピジェネティクス / CRISPR/Cas9

Outline of Annual Research Achievements

1)ランダムプライミングを用いないPBAT法(PBAT2.0)の開発
ランダムプライミングを用いる現行PBAT法の欠点を解消するために、バイサルファイト変換済１本鎖DNAへのアダプター付加法について検討を加えた。まず、ランダム配列からなる5'突出末端を有する２本鎖アダプターをT4 DNAリガーゼで連結させる方法について、モデルオリゴヌクレオチドへの高い連結を確認した。一方、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)と修飾塩基を用いて、限定的なテーリングを行う方法についても検討を加えて、一定の有効性を認めた。更にTdT反応と化学的手法とのハイブリッド法の着想を得て予備的な結果を得た。
2)CRISPRによる部位特異的エピ変異導入
DNase活性を消失したCas9変異体dCas9にDNAやヒストンの修飾酵素を連結したものを発現させて部位特異的エピ変異導入を目指す。そのための基礎条件検討として、dCas9-GFPを出芽酵母のrRNA遺伝子座位にターゲティングすることを試みた。しかしながら、期待された核小体蛍光シグナルの増強が認められなかったため、sgRNAの発現とプロセシング、およびCas9によるin vitro標的切断を行う実験系をそれぞれ構築して評価を行った。その結果、sgRNAについては問題がなかったものの、Cas9自身に核小体に集積する性質があることが判明した。そこで計画を変更して、株によっては20コピーの遺伝子が縦列反復するCUP1遺伝子座に対象を変更して、再検討に着手して予備的な結果を得た。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

PBAT2.0の開発については順調に基礎データが蓄積しており、それに基づく新しいユニークな方法の着想も得られた。
CRISPRによる部位特異的エピ変異導入については予想外の困難の遭遇による遅れもあったが、その結果、当初計画にはなかった評価系が確立されて、今後の研究の加速に繋がることが期待される。

Strategy for Future Research Activity

PBAT2.0の開発については前年度の結果に基づいて、全くユニークなハイブリッド法の着想が得られたため、その可能性の追求を行う。と同時に、現実的な方策として、DNA-SMART法の導入も試みる。
CRISPRによる部位特異的エピ変異導入については、類似の報告が相次いだこともあり、特異性向上の点での独自性の発揮を目指して、Protein-Fragment Complementationの利用を図る。その一環としてBimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)による特異性の高い視覚化に力点を置く