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2016 Fiscal Year Annual Research Report

CRISPR-mediated reading and writing of the epigenome

Research Project

Project/Area Number 26250038
Research InstitutionKyushu University

Principal Investigator

伊藤 隆司  九州大学, 医学研究院, 教授 (90201326)

Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
KeywordsdCas9 / BiFC / エピジェネティクス
Outline of Annual Research Achievements

【ランダムプライミングによらないPBATの開発】ssDNAの3'末端にTdTを用いて3'-azido-dGTPを付加した後で、クリックケミストリーを用いて5'-エチニル化オリゴヌクレオチドと連結する基盤技術TdT-assisted Chemical ssDNA (TCS) ligationを開発して論文発表した。
【部位特異的エピ変異導入】出芽酵母のCUP1遺伝子は銅耐性を付与する遺伝子で、銅イオンによってプロモーターにリクルートされる転写因子CUP2によって誘導される。cup2欠損株中で、dCas9にヒストンアセチル化酵素p300を付加したdCas9-p300をCUP1遺伝子にターゲティングしたところ、銅感受性が部分的に抑圧された。この結果は、プロモータのヒストンアセチル化亢進によってCUP1遺伝子の基底発現レベルが上昇したものと考えられた。
【エピジェネティック修飾の部位特異的生細胞可視化】高感度生細胞可視化用にmNeonGreen (mNG) による二分子蛍光相補法(BiFC)を開発した。細胞内存在量が32分子に過ぎない出芽酵母セントロメア特異的ヒストンバリアントCse4に適用したところ、タイムラプス観察が可能な感度を持つことが示された。更に、CUP1遺伝子プロモータにターゲティングしたdCas9-CUP2間のBiFCを検討した。当初、CUP2-mNG融合タンパク質の局在異常等のトラブルが生じたが、株の変更で問題を解決できた。その結果、銅の添加によってdCas9-CUP2間のBiFCが特異的に誘導されることが確認できた。これにより、dCas9を利用して特定のゲノム座位近傍へのタンパク質結合をBiFCによって生細胞観察できることが実証された(投稿準備中)。現在、ヒストンのアセチル化をリーダータンパク質-dCas9間のBiFCで検出する試みを進行中である。

Research Progress Status

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

  • Research Products

    (6 results)

All 2018 2017 2016

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 4 results) Presentation (1 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results)

  • [Journal Article] Post-Bisulfite Adaptor Tagging for PCR-Free Whole-Genome Bisulfite Sequencing.2018

    • Author(s)
      Miura F, Ito T
    • Journal Title

      Methods Mol Biol

      Volume: 1708 Pages: 123-136

    • DOI

      10.1007/978-1-4939-7481-8_7.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Triazole linking for preparation of a next-generation sequencing library from single-stranded DNA.2018

    • Author(s)
      Miura F, Fujino T, Kogashi K, Shibata Y, Miura M, Isobe H, Ito, T
    • Journal Title

      Nucleic Acids Res.

      Volume: 46 Pages: in press

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Software updates in the Illumina HiSeq platform affect whole-genome bisulfite sequencing.2017

    • Author(s)
      Toh H, Shirane K, Miura F, Kubo N, Ichiyanagi K, Hayashi K, Saitou M, Suyama M, Ito T, Sasaki H
    • Journal Title

      BMC Genomics

      Volume: 18 Pages: 31

    • DOI

      10.1186/s12864-016-3392-9.

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] DNA Methylome Analysis Identifies Transcription Factor-Based Epigenomic Signatures of Multilineage Competence in Neural Stem/Progenitor Cells.2017

    • Author(s)
      Sanosaka T, Imamura T, Hamazaki N, Chai M, Igarashi K, Ideta-Otsuka M, Miura F, Ito T, Fujii N, Ikeo K, Nakashima K
    • Journal Title

      Cell Reports

      Volume: 20 Pages: 2992-3003

    • DOI

      10.1016/j.celrep.2017.08.086.

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] DNA Methylation Errors in Cloned Mouse Sperm by Germ Line Barrier Evasion.2016

    • Author(s)
      Koike T, Wakai T, Jincho Y, Sakashita A, Kobayashi H, Mizutani E, Wakayama S, Miura F, Ito T, Kono T
    • Journal Title

      Biol Reprod.

      Volume: 94 Pages: 128

    • DOI

      10.1095/biolreprod.116.138677.

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Development of BiFC system based on a bright and photo-stable fluorescent protein for detecting a limited number of protein-protein interactions2017

    • Author(s)
      Okada S, Nakagawa S, Kamino S, Ito T
    • Organizer
      ASCB/EMBO 2017 Meeting
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2018-12-17  

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