2014 Fiscal Year Annual Research Report
損傷クロマチンダイナミクスとTIP60複合体のアセチル化ネットワークの解明
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26281020
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
井倉 毅 京都大学, 放射線生物研究センター, 准教授 (70335686)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アセチル化 / ヒストンH2AX / TIP60 / リン酸化 / DNA損傷応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題の目的は、TIP60ヒストンアセチル化酵素複合体によるアセチル化を介したH2AXのクロマチンからの放出が、ヒストンH2AXのリン酸化を介したDNA損傷応答シグナルの活性化とどのような関係にあるのかを明らかにすることである。これまでにTIP60による損傷領域のヒストンのアセチル化が、TIP60複合体の構成因子のアセチル化を誘導し、損傷領域でアセチル化の連動が起きることを明らかにした。このアセチル化連動がDNA損傷に伴うH2AXのリン酸化シグナルの増幅をDNA損傷領域に限局させている可能性がある。TIP60によるH2AXのアセチル化によって、TIP60複合体の構成因子TBRのアセチル化が増強され、その結果、TBRのATP分解活性が亢進することを確認している。さらにTBRのATP分解活性が、損傷領域のチェックポイント蛋白質の安定性に関与することを明らかにした。このチェックポイント蛋白質は、H2AXのリン酸化によって形成されるフォーカス形成に関与することから、TIP60によるTBRのアセチル化がH2AXのリン酸化カスケードによるDNA損傷応答シグナルを調整している可能性がある。また本課題では、放射線障害に対するこのアセチル化連動の変化を定量プロテオミクス解析により検討することを予定している。本年度は、京都大学工学部の松田知成博士との共同研究により、放射線障害によって生じるアセチル化、リン酸化、メチル化などのヒストンの化学修飾およびTIP60複合体の構成因子を始め、様々なDNA修復因子、チェックポイント蛋白質を定量する系が立ち上がり、H2AXのリン酸化とヒストンのアセチル化、TBRのアセチル化との関係を定量的に解析することが可能になった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TIP60ヒストンアセチル化酵素複合体の構成因子であるTBRのアセチル化が、TIP60によるH2AXのアセチル化によって増幅されるかについては、H2AX-H2BおよびH2A-H2BをTIP60によってin vitroでアセチル化させ、これらアセチル化ヒストンの存在下でTIP60複合体による TBRに対するアセチル化が亢進するか否かを検討した。その結果、少なくともin vitroアセチル化アッセイでは、両者に違いを見出せることはできなかった。しかし、TIP60によるTBRのアセチル化の生理的な意義として、H2AXのリン酸化カスケードを介したDNA損傷応答シグナル活性化に関与するチェックポイント蛋白質の安定性への関与を示唆する結果を得たこと、さらにDNA損傷に伴うヒストンの化学修飾やTBRを含めたTIP60複合体の構成因子の細胞内での分子数を定量するためのMRNが順調に立ち上がり、研究はおおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、放射線照射（低線量を含む）後のH2AXのリン酸化とH2AXのアセチル化について定量プロテオミクス解析であるMRNを用いて両者の比較定量を行い、これまでに蛍光免疫組織学的解析によって得られた定性的な実験結果を再確認し、線量との関係を検討する。それに基づき、H2AXのアセチル化変異体遺伝子を発現させた細胞においてH2AXのリン酸化が増強されるかについて検討する。TBRのアセチル化変異体遺伝子発現細胞もすでに作成しているので同様の実験でH2AXのリン酸化とアセチル化連動との関係を検証する。TBR以外のTIP60によってアセチル化されるTIP60複合体の構成因子の検討であるが、幾つかの候補は同定している。今後は、特異的アセチル化抗体を作成して検討を開始する。また蛍光組織学的解析では超高解像度顕微鏡3D-SIMを用いて行うが、この実験は、広島大学原爆放射線医科学研究所の田代教授の指導の下に行う。
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| Causes of Carryover |
本課題では、ヒストンのアセチル化抗体が必要になるが、当初予定していたアセチル化部位の抗体の他に同じヒストンの他の部位でのアセチル化抗体を作成する必要が出てきた。またアセチル化関連因子の抗体も作成する必要も出てきた。抗体を作成する場合には時間がかかり、そのため繰越しを行った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初予定していたアセチル化抗体とは別の部位のアセチル化抗体とアセチル化関連因子の抗体作成、そしてその抗体を用いた蛍光免疫組織学的解析、主にPLA解析用の試薬購入に使用する予定である。
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