2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26281043
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
松本 謙一郎 北海道大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80360642)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大井 俊彦 北海道大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (40223713)
田口 精一 北海道大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (70216828)
佐藤 敏文 北海道大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (80291235)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バイオベースポリマー / 酵素重合 / ポリエステル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、石油資源の節約と大気中の二酸化炭素濃度の上昇の抑制の観点から、バイオマスを利用した物質生産系の開発が重要視されている。バイオマス利用の強力なプラットフォームとなるのが、微生物プロセスである。バイオマスを利用するためには、低分子量化すると同時に、培養の阻害物質を除去する必要があるが、微生物の代謝機能を利用することで、混合物（たとえば、複数の糖を含む糖液）からでも単一の化合物が合成できる。我々の研究グループでは、微生物が産生するポリエステルの合成機構について研究を行っている。このポリエステルは、生体高分子でありながら、ポリプロピレンのような汎用樹脂に類似した物性を示すことから、バイオマス由来プラスチックとして期待される。類似した合成系としては、乳酸発酵により合成した乳酸を化学重合して得られるポリ乳酸が知られるが、微生物産生ポリマーは、モノマーの合成と重合が単一発酵プロセスで完結するのが特徴である。我々は、微生物のポリエステル合成系に人工的に改変を加えることにより、天然では見られない非天然モノマーユニットを含むポリマーを合成することに取り組んでいる。非天然ユニットを共重合することで、多様なポリマーを合成することができるため、その中から優れた物性を有する材料を探索しているが、本研究ではとくにモノマーの重合様式に着目した。共重合体の生合成では、通常は複数種類のモノマーの重合様式はランダムになることが知られている。一方、我々は、非天然ポリマーの合成研究を通じて、モノマー配列のランダム性の低い共重合体が合成される系を見出した。本研究では、本ポリマーの合成系について、ポリマーの構造解析、物性解析、合成系の酵素解析を行い、ランダム性の低いポリマーが合成される機構と、ポリマーの構造・物性相関について研究を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
配列制御性ポリマーの生合成系について、第一段階として培養条件の検討を行い、大腸菌の遺伝子導入条件、培養条件、培地の条件を種々検討した。ポリマー合成量の分析は、ポリマー総量の分析については、ガスクロマトグラフィー、またはガスクロマトグラフィー質量分析計を用いて行い、ポリマーの構造解析は、核磁気共鳴により行った。ポリマー分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィーにより測定した。結果、モノマーの組成をコントロールでき、良好なポリマー収率が得られる培養条件を決定した。次にポリマーの構造解析を行い、溶媒分別によりポリマーの分離精製を行い、核磁気共鳴で構造解析を行った結果、２つのセグメント間が結合していることが確認できた。ついで、本ポリマーの合成に関する酵素の性質の解析を行った。モノマー供給系酵素と重合酵素のそれぞれについて、ヒスタグ融合タンパク質を発現させ、アフィニティークロマトにて一段階精製を行った。さらに、酵素アッセイに用いる基質の合成を行った。合成した基質は、分取液体クロマトグラフィーにより精製したのち、その分子量を液体クロマトグラフィー質量分析計により確認した。得られた精製タンパク質の速度論的解析を行い、各酵素の反応速度を測定することができた。この結果に基づいてポリマー合成機構について考察を行った。これらの結果により、研究開始時に想定していた実験内容はおおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、酵素活性の測定をより詳細に行う。基質濃度や酵素濃度を変えた時の反応速度を計測し、種々の条件でどのような重合反応が起こっているのかを明らかにする。また、酵素反応で合成されたポリマーを回収・抽出し、核磁気共鳴法によるポリマー構造の解析を行う。これらと並行して、細胞内のポリマー合成中間体の解析を行って、試験管内反応による解析が、細胞内の状況を反映しているかを確認する。
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| Causes of Carryover |
現在行っている実験結果を十分に見極めたうえで、次の実験計画を策定するため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
現在行っている実験を強化するためにクロマトグラフィー等の装置を導入する
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Research Products
(4 results)
