2014 Fiscal Year Annual Research Report
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26290033
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
真下 知士 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80397554)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金子 武人 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30332878)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / ラット / 遺伝子 / 脳神経疾患 / 実験動物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、CRISPRを用いた実験用ラットにおける新しいゲノム編集基盤技術の開発を目指している。平成26年度は、ラットにおけるゲノム編集として、特性が一目でわかるアルビノ（Tyr）、アグーチ（Asip）、頭巾斑（Kit）の毛色遺伝子を標的とした。
１）Cas9、gRNAをin vitro転写し、DA系統の受精卵にインジェクションすることで、Tyrノックアウトラットを作製した。
２）Cas9、gRNA 、ssODNをF344系統にインジェクションすることで、Tyr遺伝子ミスセンス変異を野生型にSNP置換（レスキュー）した。
３）Asip遺伝子の欠失変異に対して、ssODNにより十数bp挿入を行い、アグーチラットを作製した。
４）Kit遺伝子のERV（9K-bp）挿入変異に対して、二つのgRNAとssODNを利用してERVを欠失させることで、全身野生色のラットを作製した。
以上の研究成果を取りまとめて、英国科学誌Nature Communications（英国ネイチャー出版グループ オープンアクセス誌）から報告した。また、総説として英文1編、和文6編、プロトコールとして英文1編、和文1編を取りまとめた。招待・教育・シンポジウム講演等として国際2回、国外8回の発表を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度は、ラットにおけるゲノム編集として、特性が一目でわかるアルビノ（Tyr）、アグーチ（Asip）、頭巾斑（Kit）の毛色遺伝子を標的として、実験を行った。
１）Cas9、gRNAをin vitro転写し、DA系統の受精卵にインジェクションすることで、Tyrノックアウトラットを作製した。２）Cas9、gRNA 、ssODNをF344系統にインジェクションすることで、Tyr遺伝子ミスセンス変異を野生型にSNP置換（レスキュー）した。３）Asip遺伝子の欠失変異に対して、ssODNにより十数bp挿入を行い、アグーチラットを作製した。４）Kit遺伝子のERV（9K-bp）挿入変異に対して、二つのgRNAとssODNを利用してERVを欠失させることで、全身野生色のラットを作製した。
以上のことから、平成26年度開始当初の研究計画の通りに、おおむね順調に進展していると自己評価する。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、CRISPRを用いた実験用ラットにおける新しいゲノム編集基盤技術の開発を目指している。平成26年度は、CRISPR/Cas技術により、１）Tyr遺伝子のノックアウト、２）Tyr遺伝子ミスセンス変異を野生型へSNP置換（レスキュー）、３）Asip遺伝子の欠失変異に対して、ssODNにより十数bp挿入（レスキュー）、４）Kit遺伝子のERV（9K-bp）挿入変異に対して、二つのgRNAとssODNを利用してERVの欠失を行った。
引続き、ゲノム編集基盤技術の開発として、５）カセットノックイン（数Kbp挿入）として、F344ラットのRosa26プロモーター下流にGFP遺伝子をノックインすることで、GFPレポーターラットの作製を行う。６）Cas9 GFP Tgラットの脳、肝臓などの各組織へアデノウイルスベクターやレンチウイルスベクターにより、GFP 配列を標的とするgRNAを導入する。肝臓には尾静脈、門脈からインジェクション、脳内には脳室内、嗅球からのインジェクションを検討する。gRNA導入後に、FACSによるGFP発現解析、Surveyorアッセイ、シークエンス法によりゲノム編集効率を評価する。また、７）ラットゲノム編集技術を用いて、新規パーキンソン病モデルラットの開発を検討する。
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| Remarks |
http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/home_jp.aspx
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