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2014 Fiscal Year Annual Research Report

乳癌治療に向けた分子基盤としてのBRCA1の機能解析

Research Project

Project/Area Number 26290042
Research InstitutionSt. Marianna University School of Medicine

Principal Investigator

太田 智彦  聖マリアンナ医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60233136)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 朴 成和  国立研究開発法人国立がん研究センター, 中央病院, 科長(課長・グループリーダークラス) (50505948)
Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords乳癌 / 治療 / BRCA1 / BARD1 / DNA損傷
Outline of Annual Research Achievements

①野生型、②I26A(BARD1との結合を維持したままUbcH5cとのE3活性を死活した変異体)および③I26Aにさらに2カ所のミスセンス変異を加えてUbcH5c以外のE2とのE3活性も死活した変異体 (ILK)のBRCA1コンストラクトを作成した。レンチウィルスベクターを用いてDoxycyclin誘導性にBRCA1に対するshRNAと同時にこれらの変異体を発現誘導して、内因性BRCA1と変異体を置換しうるHeLa細胞株とU2OS細胞株を樹立した。これらの細胞を用いて、放射線照射後のDNA修復因子のDNA損傷部位への集積を蛍光免疫染色にてγH2AXとの共局在で解析したところ、BRCA1-ILK変異体ではRAD51の核内foci形成が抑制されていた。さらに、ヘテロクロマチンプロテイン1(HP1)ファミリーであるHP1α、HP1β、HP1γの3つの遺伝子発現を、それぞれに対するshRNAで同時にDoxycyclin誘導性に発現抑制しうるHeLa細胞株とU2OS細胞株を樹立した。これらの細胞ではBRCA1, BARD1, CtIPおよびRAD51の放射線照射によるDNA二本鎖切断部位への集積が抑制された。また、レーザー照射にて、DNA末端切除に必要なCtIPの集積は顕著に阻害されるのに対して、BRCA1のもう一つの複合体構成因子であるRAP80の集積は全く影響を受けなかった。以上より、BRCA1のE3活性はDNA二本鎖切断修復において下流の因子の集積に重要であること、HP1はDNA末端切除および相同組換え修復に必須の役割を果たしており、RAP80/BRCA1複合体はこれとは異なった経路に関与していることが示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Doxycyclin誘導性の細胞株など、今後の解析に必要なreagentの準備がおおむね完了していること、初期の結果として予想している結果が得られていることから、おおむね順調と判断した。

Strategy for Future Research Activity

上記の細胞を用いて、DNA損傷時のChIPアッセイにて構造ヘテロクロマチン、条件的ヘテロクロマチンあるいはユークロマチンのヒストン修飾状況を解析する。 網羅的な遺伝子のサイレンシングを解析するために簡易型次世代シーケンサーを用いてChIP-シーケンス解析を行う。また、IR照射あるいはレーザーマイクロ照射後のDSBに、早期あるいは後期に集積する修復蛋白質の変化を蛍光免疫染色にて、また一本差DNA形成をnon-denature条件のBrdU染色にて解析する。DR-GFPによるgene-conversionレポーターにて相同組み替え修復能を解析する。 H3K9me領域のヘテロクロマチン・サイレンシングの状態を解析し、DNA損傷前後の変化を検討する。

Causes of Carryover

平成27年1月に受理された論文の印刷代、同時期に投稿した論文にかかる費用、これらの論文のNative Checkにかかる費用に対する請求が4月以降に来ることがわかっていたため、これに必要な経費として約100万円の繰越金額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

論文印刷代として約50万円、現在投稿中の論文の印刷代、約30万円、Native Checkにかかる費用として約20万円を使用する予定である。

  • Research Products

    (12 results)

All 2015 2014 Other

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results) Presentation (7 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] NF-kB signaling mediates acquired resistance after PARP inhibition.2015

    • Author(s)
      Nakagawa Y, Sedukhina AS, Okamoto N, Nagasawa S, Suzuki N, Ohta T, Hattori H, Roche-Molina M, Narváez AJ, Jeyasekharan AD, Bernal JA, Sato K.
    • Journal Title

      Oncotarget.

      Volume: 6 Pages: 3825-3539

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Interaction of BARD1 and HP1 is required for BRCA1 retention at sites of DNA damage.2015

    • Author(s)
      Wu W, Nishikawa H, Fukuda T, Vittal V, Asano M, Miyoshi Y, Klevit RE, Ohta T.
    • Journal Title

      Cancer Res.

      Volume: 75 Pages: 1311-1321

    • DOI

      10.1158/0008-5472

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] LSD1 Overexpression Is Associated with Poor Prognosis in Basal-Like Breast Cancer, and Sensitivity to PARP Inhibition.2015

    • Author(s)
      Nagasawa S, Sedukhina AS, Nakagawa Y, Maeda I, Kubota M, Ohnuma S, Tsugawa K, Ohta T, Roche-Molina M, Bernal JA, Narváez AJ, Jeyasekharan AD, Sato K.
    • Journal Title

      PLoS One.

      Volume: 10 Pages: e0118002

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0118002

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Ubiquitin acetylation inhibits polyubiquitin chain elongation.2015

    • Author(s)
      Ohtake F, Saeki Y, Sakamoto K, Ohtake K, Nishikawa H, Tsuchiya H, Ohta T, Tanaka K, Kanno J.
    • Journal Title

      EMBO Rep.

      Volume: 16 Pages: 192-201

    • DOI

      10.15252/embr.201439152

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] BRCA1 retention at DNA double-strand breaks in homology-directed repair pathways2014

    • Author(s)
      Tomohiko Ohta
    • Organizer
      International Symposium on Homeostasis through development, life, and diseases
    • Place of Presentation
      群馬大学(群馬県前橋市)
    • Year and Date
      2014-11-07
  • [Presentation] HP1 amma mediates BARD1 retention on Lys9-dimethylated histone H3 at sites of DNA damage2014

    • Author(s)
      Tomohiko Ohta, Hiroyuki Nishikawa, Anna S. Sedukhina, Takayo Fukuda, Wenwen Wu
    • Organizer
      Fusion Conference DNA Replication as a Source of DNA Damage
    • Place of Presentation
      カサブランカ(モロッコ)
    • Year and Date
      2014-10-02
  • [Presentation] Therapeutic strategy targeting the mechanism of BRCA1 retention at DNA damage sites via a histone modification.2014

    • Author(s)
      太田智彦
    • Organizer
      第73回日本癌学会学術総会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • Year and Date
      2014-09-25
  • [Presentation] ATM-dependent but RNF168-independent BRCA1/BARD1 retention at sites of DNA damage2014

    • Author(s)
      Tomohiko Ohta, Hiroyuki Nishikawa, Anna S. Sedukhina, Takayo Fukuda, Wenwen Wu
    • Organizer
      Benzon Symposium No 60 - Nuclear Regulation by Ubiquitin
    • Place of Presentation
      コペンハーゲン(デンマーク)
    • Year and Date
      2014-08-18
  • [Presentation] BRCA1のDNA損傷応答とヒストン修飾2014

    • Author(s)
      太田智彦
    • Organizer
      第19回日本病態プロテアーゼ学会学術集会
    • Place of Presentation
      千里ライフサイエンスセンター(大阪府豊中市)
    • Year and Date
      2014-08-09
  • [Presentation] BRCA1の新規DNA損傷応答メカニズムを標的とした治療戦略2014

    • Author(s)
      太田智彦
    • Organizer
      第22回日本乳癌学会学術総会
    • Place of Presentation
      大阪国際会議場(大阪府大阪市)
    • Year and Date
      2014-07-10
  • [Presentation] BRCA1の新規クロマチン結合機構を標的としたがん治療戦略2014

    • Author(s)
      太田智彦
    • Organizer
      第15回ホルモンと癌研究会
    • Place of Presentation
      艮陵会館(宮城県仙台市)
    • Year and Date
      2014-07-04
  • [Remarks] 聖マリアンナ医科大学大学院 医学研究科 応用分子腫瘍学

    • URL

      http://www.marianna-u.ac.jp/t-oncology/index.html

URL: 

Published: 2016-06-01  

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