2016 Fiscal Year Annual Research Report
複合的構造解析による膜内プロテアーゼRsePの膜内・膜外での基質認識機構の解明
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26291016
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
禾 晃和 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 准教授 (40379102)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 毅 大阪大学, たんぱく質研究所, 講師 (90403013)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / シグナル伝達 / 酵素 / 膜蛋白質 / 立体構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、２つの生物種由来の標的膜タンパク質について、重点的に結晶化条件の探索を行った。うち１種については、タグ配列を分子内部に挿入したコンストラクトを作製し、抗体断片との複合体の結晶化に取り組んだところ、単結晶が得られる条件が見つかった。しかしながら、結晶化の再現性は低く、また、同じようなサイズの結晶を用いても回折点が観測される場合とされない場合もあり、安定したデータ収集を行うためには、さらなる条件検討が必要であることがわかった。また、もう１種の標的膜タンパク質については、結晶化条件のスクリーングから比較的多数の条件を見つかっている上、結晶化の再現性も比較的良好であった。そこで、放射光施設の微小結晶用のビームラインを利用してX線回折実験を行ったところ、低分解能ながらも回折データの収集を行うことができた。ただし、現状のデータセットは、構造決定可能な分解能には達していないため、先行研究で取得した標的膜タンパク質に対するモノクローナル抗体を断片化し、複合体の結晶化にも取り組んだ。このモノクローナル抗体は、標的膜タンパク質の可溶性ドメインを断片化して精製し、マウスに免疫して作製したものであった。モノクローナル抗体は免疫した部分断片だけでなく、全長の膜タンパク質に対しても高い親和性を示したが、抗体の結合によって標的の膜タンパク質が不安定化することも分かった。以上の結果から、抗体断片との複合体での結晶化を目指す場合は、抗体結合部位の最適化を行う必要があることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
抗体との複合体形成については、さらなる条件検討が必要であるが、標的膜タンパク質の１つについては、低分解能ながらも回折データの収集に成功しており、構造決定に向けて進展が見られたと言えるから。
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| Strategy for Future Research Activity |
すでに回折データが得られた標的膜タンパク質については、結晶化条件の最適化や抗体断片との複合体での結晶化条件の探索を進めることで、原子レベルの分解能での構造決定を達成したいと考えている。別種の膜タンパク質については、タグ配列挿入部位の最適化を行うことで、安定して結晶が得られ、データ収集を行うことが可能な条件を探索する。また、基質との複合体での構造決定を目指し、安定して結合する基質の探索にも取り組んでいく。
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| Causes of Carryover |
X線回折データが得られている膜タンパク質については、抗体断片との複合体を作成することで、X線回折の分解能を向上させることを計画していたが、元々可溶性領域の部分断片を用いて抗体を作製したためか、全長タンパク質に対して抗体を結合させると、タンパク質が不安定になってしまった。このため、全く異なる方法によって抗体を結合させる条件を検討しなければならない状況となり、使用計画の変更が必要となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
標的タンパク質については可溶性領域の部分構造が研究代表者の先行研究によって明らかになっている。そこで、可溶性領域の構造情報に基づいて、抗体結合部位の最適化を行い、安定な状態で標的膜タンパク質と抗体断片の複合体を精製する条件を確立する。そして、安定な複合体を用いて、結晶解析を進めていくことを計画している。
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[Journal Article] 3D structural analysis of protein O-mannosyl kinase, POMK, a causative gene product of dystroglycanopathy.2017
Author(s)
Nagae M, Mishra SK, Neyazaki M, Oi R, Ikeda A, Matsugaki N, Akashi S, Manya H, Mizuno M, Yagi H, Kato K, Senda T, Endo T, Nogi T, Yamaguchi Y
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Journal Title
Genes to Cells
Volume: 22
Pages: 348-359
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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