メロン遺伝資源を活用した日持ち性に関する分子生物学的解析

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26292018
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 中野 龍平 岡山大学, その他の研究科, 准教授 (70294444)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 鎌司 岡山大学, その他の研究科, 教授 (40161096) ; 村上 賢治 石川県立大学, 公私立大学の部局等, 教授 (40200266) ; 高居 恵愛 石川県立大学, 公私立大学の部局等, 准教授 (70589770)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: メロン / 棚持ち性 / 遺伝資源 / エチレン / 軟化

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、申請グループが保有するメロン遺伝資源を活用し、公開されたメロン全ゲノム配列や次世代シークエンサーによる解析手法と組合せ、収穫後の日持ち性に関連する遺伝子の同定を目的としている。本年度には以下の成果が得られた。
I) B2メロンが持つ日持ち性の向上に関わる遺伝的変異の探索：メロンのエチレン信号伝達関連因子に関して、網羅的な解析を実施した。 B2において春３など通常のメロンと比べて、エチレンシグナル伝達系因子に違いが見いだされなかった。一方で、B2に外生的にエチレンと同じ作用を持つプロピレンを処理したところ、自己触媒的エチレン生成は誘導されるにも関わらず、軟化は誘導されずプロピレン存在下でも日持ち性が良いことが明らかとなった。
II) ハミウリが持つ日持ち性向上因子の遺伝的、分子生物学的同定：ハミウリとシャランテの交配後代の中に、自己触媒的エチレン誘導および軟化とも抑制されている系統と自己触媒的エチレン誘導は起こるにも関わらず軟化抑制されている２種類の系統が見出された。日持ち性の良い系統を選抜しつつシャランテへの戻し交雑を繰返しBC2F2世代まで得られている。
III) ハネーデューが持つ日持ち性向上因子の分子生物学的解析：ハネーデューおよびシャランテのRNA-Seqによる網羅的発現解析を実施した。無処理の果実、エチレン処理した果実、エチレン作用性阻害剤1-MCPを処理した果実の解析を用いて解析した結果、細胞質分解関連タンパク質、エチレン情報伝達系、転写因子群を含むに様々なタンパク質をコードする遺伝子に関して、その発現制御のエチレン依存性とともに、日持ち性と関連した違いを示す候補遺伝子が見出された。
VI)幅広い系統に応用可能なメロン遺伝子組換え体の作成法の確立およびその活用：シャランテにおいて葉切片からの再生系が明らかとなっており、選抜マーカーの調査を進める準備が整った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

以下のように、すべての項目において、本年度の目標は概ね達せいされるともに、次年度以降のさらなる解析への準備が進んでいる。
I) B2メロンが持つ日持ち性の向上に関わる遺伝的変異の探索：B2においてエチレンシグナル伝達系因子に変異は見出されなかったが、これは計画時から想定内の結果である。プロピレン処理の結果より、B2は自己触媒的エチレン生成能を保持するものの、軟化しにくいことが明らかとなった。この調査に際して、信頼できるサンプルの獲得に成功しており、来年度以降、網羅的解析を進める準備ができている。
II) ハミウリが持つ日持ち性向上因子の遺伝的、分子生物学的同定：ハミウリとシャランテの交配後代より、２タイプの日持ち性の良い系統（自己触媒的エチレン誘導および軟化とも抑制されている系統と軟化のみ抑制されている系統）の選抜に成功しており、想定以上の成果が得られている。シャランテへの戻し交雑を順調に実施しており、将来的なRe-Seq解析に向けて、遺伝的バックグランドﾞが近く、日持ち性に関して分離する集団の育成が進んでいる。
III) ハネーデューが持つ日持ち性向上因子の分子生物学的解析：RNA-Seqによる網羅的発現解析によるハネーデューとシャランテの比較より、日持ち性と関連した違いを示す複数の候補遺伝子の獲得に成功している。さらに、ハネーデューとシャランテのF2集団を獲得できており、次年度以降、遺伝的要素も組み込んで、これら候補遺伝子のより詳細な解析や絞り込みを実施する準備が整っている。
VI)幅広い系統に応用可能なメロン遺伝子組換え体の作成法の確立およびその活用：遺伝子組換え体の作成法の確立における、重要な段階の一つである再生系が明らかとなっており、今後、抗生物質の選択など組換え系の開発を進める準備が整った。

Strategy for Future Research Activity

研究計画の大きな変更はなく、今後、以下の方策により研究を推進する。
I) B2メロンが持つ日持ち性の向上に関わる遺伝的変異の探索：エチレンシグナル伝達系因子の変異の可能性は小さくなったので、B2および対照品種の春３に関して、本年度に経時的にサンプリングしたプロピレン処理有り、および、無処理のサンプルを用いてRNA-Seqによる網羅的解析を進め、日持ち性の候補遺伝子を探索する。さらに、B2 x 春３の交配後代を育成し、B2の日持ち性の遺伝的解析を進めるとともに、Re-Seq解析などにより候補遺伝子のさらなる解析と絞込みを進める。
II) ハミウリが持つ日持ち性向上因子の遺伝的、分子生物学的同定：ハミウリに関しては、」シャランテとの交配後代において２タイプの日持ち性の良い系統の選抜に成功しており、複数の日持ち性に関与する遺伝子の存在が想定される。これら２タイプの形質を追いかけつつ、引き続きシャランテへの戻し交雑を行い、遺伝的バックグランドﾞが近く日持ち性に関して分離する集団の育成し、最終的にはRe-Seq解析により原因遺伝子の同定を試みる。
III) ハネーデューが持つ日持ち性向上因子の分子生物学的解析：RNA-Seqによる網羅的発現解析の結果をさらに精査し、候補となる遺伝子の絞込みを実施する。ハネーデューとシャランテの交配後代に関しては、比較的、早い段階の世代において、多数の系統を用いることにより、日持ち性と複数の次世代シークエンサーによる解析結果の相関より、原因遺伝子の同定を試みる。
VI)幅広い系統に応用可能なメロン遺伝子組換え体の作成法の確立およびその活用：シャランテにおいて、まずは、遺伝子組換え体の作成系の確立を目指し、確立次第、他の項目において選抜されたに日持ち性候補遺伝子の組換え体の作成を進める。平行して、改良を加えつつ、他のメロン系統に関しても組換え系の確立を目指す。

Causes of Carryover

B2メロンにおいて、第一のプランでは、日持ち性の良い原因がエチレンシグナル伝達系因子の変異によるものと推定して、その変異因子が明らかとなった場合に他品種との交配後代の解析などを予定していた。しかしながら、エチレンシグナル伝達系因子の変異は見つからなかった。一方で、エチレンのアナログであるプロピレンを処理した貯蔵試験の結果より、自己触媒的エチレン生成などエチレン感受性は示すが、果肉硬度の低下が見られず、軟化に特化した変異であるという興味深い結果が得られた。そこで、第二のプランであるRNA-Seqによる網羅的解析に計画をシフトした。RNA-Seq用のサンプルの獲得など、準備は整っているが、多くのサンプルを同時に解析する方が節約できるという背景もあり、解析用のライブラリの構築やRNA-Seq解析の発注には至っておらず、その額を次年度使用額として繰り越した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

H26の間に、すでに、B2とその対照品種である春３に関して、エチレンのアナログであるプロピレンを処理し、軟化の誘導と日持ち性に大きな差がある果実について経時的なサンプリングに成功している。また、メロン果実からのRNA抽出法に関してもHot Borate法がRNAの質的に最適であることが確認できている。そこで、１）上記よりRNAを抽出し、２）まずは、Real Time RT-PCRによりエチレン生合成および軟化に関連する主要な遺伝子の解析を行い、サンプルおよびRNAが解析に適しているか確認する。３）続いて、RNA-Seq用のライブラリを作成し、４）RNA-Seqを外注する。５）データを解析し、B2と春３の違いに関連する因子を探索する。これにより、以降の交配後代を用いたより詳細な解析や絞り込みに繋げていく計画である。