2014 Fiscal Year Annual Research Report
コウモリ由来新型レオウイルスの高度病原性獲得機序に関する研究
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26292149
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
小林 剛 大阪大学, 微生物病研究所, 特任准教授(常勤) (90324847)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | レオウイルス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コウモリレオウイルス（PRV）の高病原性獲得機序の解明を目的に本年度は以下の成果が得られた。
国内で分離されたMiyazaki株の遺伝子操作系を用いて、Miyazaki株をバックボーンとしたNelson株（コウモリ分離株）由来のS1遺伝子を持つモノリアソータントウイルスの作製に成功した。
PRV Miyazaki株における動物モデルの確立を行った。異なる3系統のマウスにMiyazaki株を接種した結果、体重減少、致死的な呼吸器症状が認められた。PRVの病原性を理解する上で本マウスモデルは極めて有用と考えられる。
PRVのS1遺伝子は株間で相同性が著しく異なる。PRVの複製機構、病態発現機序を理解するため、S1遺伝子から翻訳されるフレームの異なる3種類のタンパク質（p10、p17、sigmaC）の各種欠損ウイルスを作製し、以下の解析を行った。
p17欠損ウイルスの作製に成功し、p17はウイルス複製に必須ではないことを明らかにした。細胞表面の受容体と結合し、エントリーに必須と考えられるsigmaCを欠損させた組換えウイルスの作製を試みた。その結果、sigmaC欠損ウイルスは、増殖能を保持しており、L929細胞、Vero細胞において野生型と同程度の複製能を示した。さらに、sigmaC欠損ウイルスの感染性が顕著に低下する非感受性細胞の同定に成功した。これらの成果は、PRVの細胞侵入には、sigmaCに加えて、他の外層構造タンパク質も関与していることを示している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、PRVの高病原性獲得機序の解明ならびに細胞侵入機構の解明を目的としている。
本年度は、ヒトから分離されたPRV株とコウモリから分離されたPRV株とのリアソータントウイルスの作製に成功した。さらに、PRVの病原性研究に必須のマウスモデルの開発に成功した。これらの成果はPRV株間における病原性の比較解析ならびに高病原性に関わる分節遺伝子の同定研究に有用である。
S1遺伝子にコードされるsigmaCの欠損ウイルスを用いた解析から得られた成果は、PRVの細胞侵入に関わる宿主受容体の同定研究に有用である。
上記の成果から、研究目的を達成する上で本年度の研究計画は概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策として以下の研究項目を実施する。
1）ヒト-コウモリ由来間リアソータントウイルス、各種アミノ酸変異体の作製 コウモリ由来、ヒト由来PRV株のcDNAを組み合せることで様々なリアソータントの作製を行い、病原性に関わるウイルス側の分節遺伝子を同定する。S1遺伝子配列の相同性は株間で大きく異なっていることから、S1遺伝子のモノリアソータントウイルスの解析を中心に行う。さらにS1遺伝子にコードされるp10、p17、sigmaCについて様々な変異ウイルスを作製し、解析を行う。
2）PRVの細胞侵入機構に関する研究
sigmaC以外の細胞侵入に関わるウイルス側リガンドの同定 予想されるウイルス粒子構造から、粒子表面に存在するsigmaBがsigmaC以外のウイルス側リガンドの最有力候補と考えられる。既にsigmaCにおいて確立された方法を用いて大腸菌および培養細胞発現系により組換えタンパク質を精製し、sigmaC非依存感受性細胞の細胞膜表面における結合能を解析する。
組換えPRV sigmaCによるアフィニティー精製による宿主感染受容体の同定 sigmaC精製タンパク質を用いて、感受性細胞の膜画分から相互作用する因子のアフィニティー精製を行う。
siRNAライブラリーを用いたスクリーニング法による宿主感染受容体の同定 膜成分を含むsiRNAライブラリーをsigmaC依存感受性細胞に導入する。野生型PRVの感染後、sigmaC感染受容体を特異的にノックダウンすることで感染性が顕著に低下している陽性クローンを選別し、受容体の同定を行う。
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| Causes of Carryover |
本年度は実験経過の都合上(主にsiRNA、cDNAライブラリーを用いた感染受容体の同定研究の延期のため)、研究費に繰越金が生じた。そのため、次年度は本年度に購入できなかった消耗品、実験動物を購入する予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度請求金額については、申請書に沿って、今後の推進方策を実施するため、siRNAライブラリー、cDNA発現ライブラリー等を含む実験に必要な実験試薬、実験動物を購入する。
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[Journal Article] Imported Case of Acute Respiratory Tract Infection Associated with a Member of Species Nelson Bay Orthoreovirus2014
Author(s)
Yamanaka A., Iwakiri A., Yoshikawa T., Sakai K., Harpal S., Himeji D., Kikuchi1 I., Ueda1 A., Yamamoto S., Miura M., Shioyama Y., Kawano K., Nagaishi T., Saito M., Minomo M., Iwamoto N., Hidaka Y., Sohma H., Kobayashi T., Kanai Y., Kawagishi T. et al.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 9
Pages: e92777
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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