2015 Fiscal Year Annual Research Report
生体機能を司る蛋白質架橋化とその制御破綻に関する分子基盤
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26292192
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
人見 清隆 名古屋大学, 創薬科学研究科, 教授 (00202276)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 酵素 / カルシウム / 表皮 / 線維症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内ではタンパク質どうしが架橋形成される反応が存在し、これらは酵素ファミリーを構成するトランスグルタミナーゼ群によって、厳密な制御のもとで達成されている。例えば血液凝固や表皮形成で多数の症例があるように、これらの反応が破綻した場合には、疾患状態を生じる。トランスグルタミナーゼは８つのアイソザイムがあり、生体内の組織に特異的に局在することから、いまだ関連の不明な疾患もあると推定されている。本研究ではこのような背景から、タンパク質架橋化反応の生理的意義を明らかにし、一連の現象を分子細胞レベルで綿密に解析すると共に、モデル生物（マウス、メダカ）や細胞株で破綻を再現することを目的にしている。
これまで天然に存在する基質よりも高い反応性のペプチド（配列）を、各アイソザイム特異的に明らかにしており、蛍光やビオチンで標識し、高感度な活性測定系、活性可視化系、基質探索系を確立してきた。研究期間ではこれらの技術をさらに応用してその質を高め、疾患に伴い架橋化される基質の同定、疾患モデル生物の確立をめざしている。昨年度は予定した計画を進め、表皮細胞分化系やモデルマウスを用いて腎・肝での線維症発症に伴う基質群を探索した。その結果、候補となるタンパク質群を新たに明らかにした。また、FRETによる架橋形成を細胞内で検出するためのシステム導入を進めた。さらにモデル生物としてのメダカを用いて、トランスグルタミナーゼのオルソログ（相同遺伝子）欠損個体の作製を全て完了した。このうちいくつかについては、高浸透圧感受性の向上（皮膚異常)、行動異常など、疾患モデルとなりうる表現型を見出した。このように分子、細胞レベルでのタンパク質架橋反応の破綻を再現した場合の反応経過の知見を蓄積し、個体レベルでは破たんした生物の確立を達成する等、最終年度に向けての材料確立、知見と技術の蓄積を順調に進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画項目のほとんど全てが予定通りに進んでいる。トランスグルタミナーゼに対する高反応性基質ペプチドを用いた基質の探索を、腎および肝の線維症を発症するモデルマウスを対象として進め、特異的な新規基質候補群を多数明らかにした。また同様のアプローチによって、皮膚表皮の形成時にバリア機能の構築に貢献すると思われる新規な基質群を明らかにし、病態の皮膚形成時との違いを検討できる段階に達している。これらは、タンパク質架橋化の制御破綻が、線維症や皮膚形成異常において、どのように疾患状態を引き起こすのか、の基本的なアプローチに貢献できる知見と考えている。
また蛍光ペプチドを用いた活性の可視化システムにより、線維症や表皮形成に伴う活性変動を詳細に明らかにした。架橋反応の破綻の度合いや領域を正確に検出できることを示し、疾患の早期診断や進行状況を判定できる可能性を示した。
モデル生物としてのメダカを用いて、トランスグルタミナーゼ欠損個体を、近年進展のめざましいゲノム編集技術を用いて当初計画したとおりの変異個体を得ることができた。変異体の表現型は、疾患モデルとしての有用性を示すもので、今後の展開が期待できる。
FRETを用いた酵素活性検出系については、予定通りのin vitro では完成したものの、やや感度が目的レベルに至らず工夫の必要がある。また、細胞内において発現させるまでには至らなかった。
以上のそのため上のような自己評価に至った。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度であり研究のとりまとめを行なう。まず腎および肝の線維症での発症時に基質となる候補群について、組換えタンパク質を作製、架橋化による本来の機能の変換を解析することにより、それらの架橋化産物がどのように疾患に影響するかを明らかにする。この酵素の破綻が線維症進行に及ぼすのかについて、考察できるデータを蓄積したい。
また表皮形成については、実際の表皮に近い培養系を昨年度に確立できたので、制御破綻を模した「架橋化酵素欠損細胞」を樹立して、活性の変動を解析すると共に、その産物と表皮の状態を明らかにしたい。また、表皮形成時における新規な基質群を昨年度までに明らかにしているので、これらがバリア機能に及ぼす影響を解析するとともに、欠損や機能低下が表皮疾患を及ぼすのかについても解析したい。
モデル生物としての架橋化酵素欠損メダカについては、表現型（浸透圧感受性、行動異常）を示しているので、統計的処理による制御破綻の程度をより詳細に解析する。さらに、遺伝子発現の補償個体を得るための実験へと展開し、制御破綻から発症メカニズムの解明に至る解析へと進めたい。
FRETを用いた酵素活性検出系についても、その検出感度向上と、細胞内での発現を試みて、制御破綻の検出を細胞レベルでも容易に検出できるシステムの構築をめざす。。
最終年度であり、一連の成果を論文発表、学会発表を行なうべく並行して積極的に進めるとともに、今後の展開を見据えた応用、共同研究も考える。
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| Causes of Carryover |
新建物への異動（平成27年9月－10月）に伴い、全ての実験動物の飼育を中断したこと、実験環境の再構築ができるまでに予定の購入物が入手できなかった実験項目があったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
予定どおりの実施ができない項目があったが、移動後は順調に進めており、平成２８年度の早期に、次年度使用額はすみやかに使用する予定である。今年度が最終年度であるため、その取りまとめの中で行なえる実験もあり、それに加えて使用する。
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[Journal Article] Biochemical characterization of medaka (Oryzias latipes) transglutaminases2015
Author(s)
Kikuta A., Furukawa E., Ogawa R., Suganuma N., Saitoh M., Nishimaki T.., Katsunuma N., Oota H., Kawamoto T., Tatsukawa H., Hashimoto H., Hitomi K.
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Journal Title
PLOS One
Volume: 10
Pages: 1-13
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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