2015 Fiscal Year Annual Research Report
創薬標的としてのカルシウム依存性イオンチャネル機能複合体群の分子薬理学的研究
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26293021
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
今泉 祐治 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (60117794)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山村 寿男 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (80398362)
鈴木 良明 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (80707555)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 薬理学 / 薬学 / 生体分子 / 生理学 / 生物物理 / イオンチャネル / カルシウムシグナリング / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
① Ca2+活性化Cl-（ClCa）チャネルの生理機能とCa2+正帰還制御機構への関与の可能性解明：気道上皮繊毛細胞において、TMEM16AおよびBのmRNA発現を見出した。細胞膜電位及び細胞内Ca2+濃度測定を行った所、非選択的Cl-チャネル阻害薬であるニフルミ酸やTMEM16A阻害薬によって細胞膜電位の過分極や細胞内Ca2+濃度の上昇が起こった。また、これらの阻害薬により繊毛運動も亢進したことからTMEM16A及びBが細胞膜電位と細胞内Ca2+濃度の制御を介して繊毛運動をコントロールする可能性が示唆された。
②軟骨細胞における正帰還Ca2+制御機構の異常と細胞機能の関連の解明：低浸透圧刺激による細胞膨張後に起こる容積の減少（Regulatory volume decrease: RVD）において、ClCチャネルを介した細胞外へのCl-輸送が重要な役割を担う。そこで我々は、軟骨モデル細胞(OUMS-27)を用いて低浸透圧感受性電流に対するClCファミリーの寄与を調べた。siRNAによるノックダウン実験から、ClC-3が低浸透圧感受性電流の主要な成分の1つであることが明らかになった。一方、容量依存性アニオンチャネルの分子実体として近年報告されたLRRC8AのmRNA発現は、ヒト軟骨組織及びOUMS-27 では検出されなかった。
③一連の研究過程でOUMS-27よりBKチャネルの新規スプライスバリアント体(BKαΔe2)を発見した。詳細な解析から、BKαΔe2がストイキオメトリー依存的にBKチャネル機能を抑制することを明らかにした。また、OUMS-27に対してBKαΔe2のsiRNAを処置したところヒスタミンによって誘発されるCOX2発現が上昇した。この結果はBKαΔe2が、BKチャネル活性による正帰還Ca2+制御機構を抑制していることを示唆している。更に、BKαΔe2のmRNA発現は平滑筋組織にも認められ、BKチャネルの普遍的な抑制因子であること考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①気道上皮繊毛細胞におけるTMEM16AおよびBのmRNA・タンパク質・機能発現を見出した。さらに、これらの阻害薬により繊毛運動も亢進したことからTMEM16A及びBが細胞膜電位と細胞内Ca2+濃度の制御を介して繊毛運動をコントロールする可能性を明らかにした。
②軟骨細胞における低浸透圧感受性電流の分子実体の1つとして、ClC-3であることが明らかになった。
③OUMS-27より単離したBKチャネルの新規スプライスバリアント体(BKαΔe2)が、ストイキオメトリー依存的という新規の抑制機構を示すことを明らかにした。これにより、BKαΔe2は定常的にBKチャネルによる正帰還Ca2+制御機構を抑制すると考えられる。更に、BKαΔe2のmRNA発現は平滑筋組織にも見られ、BKチャネルの普遍的な抑制因子であること考えられた。現在論文投稿中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
①気道上皮繊毛細胞におけるTMEM16AおよびBの発現及び機能を、定量的PCR法やウエスタンブロット法などにより定量的に行う。特にパッチクランプ法による機能解析で得られた結果は、これまでに報告されているTMEM16A及びBの性質と異なるものであった。細胞内Ca2+濃度などの測定条件を改良して電流特性を明らかにする。
②変形性関節症モデル動物を作製し、各種K+チャネル及びCl-チャネルの発現変化を解析する。特に、低浸透圧感受性電流や、ヒスタミンなどのアゴニスト刺激によって起こる細胞内Ca2+濃度変化を記録し、正帰還Ca2+制御機構の変化を明らかにする。また、In vitroの系を用いて、IL-1βやTNF-αなどの炎症性サイトカインによる発現変化も明らかにする。
③H27年度では、非興奮性細胞における機能分子複合体の解析に取り組むことができなかった。最近になって、シナプトタグミンやジャンクトフィリンなどの分子が細胞膜と小胞体を結びつける分子として報告された。そこで、H28年度では軟骨細胞や血管内皮細胞などの非興奮性細胞を用いて、これらの分子が機能分子複合体を形成し得るか、蛍光イメージング法やノックダウン実験などにより明らかにする。
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| Causes of Carryover |
H27年度の途中に、１分子イメージングで使用する全反射蛍光顕微鏡のレーザーユニット及び自動シャッター制御システムが故障した。これらの新規導入のため、次年度に予算を繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
全反射蛍光顕微鏡のレーザーユニット及び自動シャッター制御システムの新規導入費用として使用する。
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