2014 Fiscal Year Annual Research Report
心機能調節におけるCCR4-NOTデアデニレースの作用機構と創薬への応用
| Project/Area Number |
26293050
|
|---|
| Research Institution | Akita University |
|---|
Principal Investigator |
久場 敬司 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10451915)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | デアデニレース / CCR4-NOT / poly(A) / 心臓 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
CCR4-NOT複合体のデアデニレース作用は、その構成因子CNOT6, CNOT6L, CNOT7, CNOT8のエキソヌクレアーゼ活性によりmRNAの3’末端からpoly(A)が短縮される脱アデニル化反応であるが、これらのデアデニレース因子によりどのmRNAが標的にされているか、標的による代謝動態に違いがあるのか、どのようなシグナルを受けてCCR4-NOTデアデニレース作用が変容するのかを明らかにする目的で、平成26年度は下記の検討を行った。
１）bulk poly(A)の長さの測定：poly(A)鎖長ごとの分画あるいは直接的なpoly(A)シーケンスの解析のため、total RNAの3’末端をdATP,[alpha-32P]でラベルし、非poly(A)配列を分解した後に電気泳動で展開したところ、CCR4-NOT欠損によりbulk poly(A)が伸長することを確認でき、poly(A)鎖長ごとのRNA分画の準備を整えることができた。
２）RNA免疫沈降シーケンスの検討： CNOT3抗体を用いたRNA免疫沈降を行い、CNOT3欠損マウスの心臓組織の発現解析との相関を調べた。その結果、CNOT3欠損によりmRNAが安定化し発現レベルが上昇する遺伝子とCNOT3抗体で沈降される遺伝子に明らかな相関は見られなかった。デアデニレースによるpoly(A)の短縮がmRNA不安定化、分解と必ずしも同義ではないことが考えられた。また、CCR4-NOTとRNAの直接的な結合を検討するために、共同研究ベースでPAR-CLIPの予備検討を開始した。
３）CCR4-NOT各サブユニット遺伝子の欠損マウスの発現解析：出生後マウス心臓のCCR4-NOT各サブユニットの蛋白発現レベルの解析に基づき、心臓でのCCR4-NOTの発現が最も高い時期にCCR4-NOT各サブユニット欠損マウスの心臓組織を採取し、次世代シーケンスによるトランスクリプトーム解析を行った。現在、各サブユニット欠損による変動遺伝子、標的遺伝子候補の相関、包含などの解析を進めている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
心臓におけるCCR4-NOTデアデニレースの作用機構の解明に向けて成果を上げつつある。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今回のCNOT3抗体によるRNA免疫沈降とCNOT3欠損マウスの心臓組織の発現解析との間に相関が無いという結果は、CNOT3抗体の特異性を確認する必要がある一方で、このことは、デアデニレースによるpoly(A)の短縮がmRNA不安定化、分解と必ずしも同義ではないことを意味しており、poly(A)鎖長との相関を見る必要があると考えられた。今後、CNOT3のみならずCNOT1やCCR4-NOTと会合するRNA結合因子についても詳細な検討を行っていく。また、通常のRIPを行うことを当初計画していたが、RNAとタンパクのUVクロスリンクにより結合の特異性を高めたPAR-CLIPの検討を共同研究ベースで開始した。また、次年度はCCR4-NOTとゲノムDNAとの相互作用も開始する予定である。
|
