2014 Fiscal Year Annual Research Report
低分子量G蛋白質Rasの翻訳後脂質修飾の役割の構造科学的研究
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26293065
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
片岡 徹 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40144472)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
島 扶美 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60335445)
枝松 裕紀 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70335438)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | シグナル伝達 / 蛋白質 / 癌 / 脂質 / 高分子構造・物性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１、黄色ブドウ状球菌Sortaseを大腸菌にて大量産生して精製した。H-RasのN末端ポリペプチド（アミノ酸番号1～166）のC末端にSortase認識配列LPKTGを付加した蛋白質（H-Ras-LPKTG）を大腸菌で大量発現して精製した。この蛋白質とH-Ras C末端領域合成ペプチドGNPPDESGPGCMSCKCVLS（アミノ酸番号172-189のN末にSortase認識配列Gを付加）を基質として、Sortaseによるin vitro蛋白質ライゲーション反応が効率的に起こる条件を検討した結果、ほぼ定量的に反応が進み全長H-Rasが大量産生・精製できる系を確立した。ファルネシル基付加等の翻訳後脂質修飾を受けたC末端領域ペプチド（GNPPDESGPGCMSCKC[Farnesyl]VLSなど）については、配列中のパルミトイル基付加を受ける２つのCys残基が障害となり化学合成が困難であることが判明した。そこで、それらをSerに置換した合成ペプチドGNPPDESGPGSMSSKCVLSをベースとして、Cys186にファルネシル基を付加したペプチド、さらにVLSを除去したペプチド、さらにCys186をカルボキシメチル化したペプチドを合成し、今後の実験に用いることとした。
２、in vitroライゲーション反応によりH-Rasのアミノ酸番号167-171を置換して挿入されるLPKTGのH-Rasの生物学的活性に対する影響について検討した。LPKTGを有する活性型変異体H-RasG12Vをヒト胎児腎由来AD293細胞にて過剰発現させたところ、LPKTGを持たないH-RasG12Vと比較して、Ras標的蛋白質c-Raf-1の活性化を介するMEK1とERK1/2のリン酸化能力に違いが見られないことから、LPKTGリンカー配列の挿入はH-Rasの生物学的活性に影響がないことが証明された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の研究計画によれば、本年度中に、種々の翻訳後修飾を受けたH-Ras蛋白質をSortaseによるin vitro蛋白質ライゲーション反応を用いて大量産生して精製し、翻訳後修飾のState 1－State 2間の高次構造遷移への影響の解析を行い、H-Ras単体及びc-Raf-1との複合体のX線結晶構造解析やNMRによる翻訳後修飾を受けたRasの構造変化及びRas-Rafの第二の結合の認識機構の解析を開始する予定であった。しかし、ファルネシル基付加等の翻訳後脂質修飾を受けたC末端領域ペプチドについて、配列中のパルミトイル基付加を受ける２つのCys残基が障害となり化学合成が困難であることが判明したことから、それらをSerに置換した合成ペプチドGNPPDESGPGSMSSKCVLSをベースとして、Cys186にファルネシル基を付加したペプチド、さらにVLSを除去したペプチド、さらにCys186をカルボキシメチル化したペプチドを合成するように実験計画の変更を余儀なくされた。その結果、ファルネシル基付加等の翻訳後脂質修飾を受けたC末端領域合成ペプチド全種類の入手が平成27年5月となり、当初の計画と比べて研究の進行がやや遅れている。本年度の研究によりSortaseを用いた定量的なin vitro蛋白質ライゲーション反応系が確立されたことから、とくに大きな遅れなく研究計画の実施が可能である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究によりSortaseによる定量的なin vitro蛋白質ライゲーション反応系が確立されたことから、パルミトイル基付加を受ける２つのCys残基をSerに置換したC末端領域ペプチドGNPPDESGPGSMSSKCVLSをベースとして、Cys186にファルネシル基を付加したペプチド、さらにVLSを除去したペプチド、さらにCys186をカルボキシメチル化した合成ペプチドを用いることにより、翻訳後脂質修飾を受けた全長H-Rasと各種修飾中間体を大量産生し精製することが可能であり、少し遅れてはいるがほぼ当初の計画通りに研究を実施する予定である。
ファルネシル基付加等の翻訳後脂質修飾を受けたC末端領域合成ペプチドを用いて、Sortaseによる定量的なin vitro蛋白質ライゲーション反応を行い、翻訳後脂質修飾を受けた全長H-Rasと各種修飾中間体を大量産生し精製する。
表面プラズモン共鳴測定法及び蛍光偏光度測定法により、種々の翻訳後修飾基をもつ合成ペプチドが大腸菌で産生・精製したH-Ras(1-166)のGDP結合型やGppNHp結合型と直接結合するかを調べる。
翻訳後脂質修飾を受けた全長H-Ras及び各種修飾中間体を用い、それら単体ならびにc-Raf-1やPLCεのRas結合ドメインとの複合体の結晶化条件を決定し、SPring-8を用いたX線結晶解析により標的蛋白質との第二の結合の認識機構を解析する。
15N及び13C同位体で標識されたH-Ras(1-166-LPKTG)とC末端合成ペプチドとをライゲーションして全長H-Rasを作製し、それらのGppNHp結合型及びGDP結合型を用いて[15N, 1H]-HSQC及び [13C, 1H]-HSQCを利用して翻訳後修飾依存性のシグナルの変化を検出することにより、C末端構造との相互作用に関与するアミノ酸残基を同定し、相互作用によって誘起される構造変化を検出する。
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| Causes of Carryover |
当初の研究計画によれば本年度中に全て購入する予定であった、ファルネシル基付加等の翻訳後脂質修飾を受けたH-Ras C末端領域合成ペプチドについて、配列中のパルミトイル基付加を受ける２つのCys残基が障害となり化学合成が困難であることが判明したことから、それらをSerに置換したペプチドGNPPDESGPGSMSSKCVLSをベースとして各種翻訳後修飾を受けたペプチドを合成するように実験計画の変更を余儀なくされた。そのため、C末端領域合成ペプチド全種類の購入及びそれらを用いた実験の実施が平成27年度にずれ込み、比較的多額の次年度使用額が生じることとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初の研究計画において、本年度中に使用する予定となっていたC末端領域合成ペプチド全種類の購入及びそれらを用いた実験を平成27年度に実施することとなり、それに対応する額の学術研究助成基金助成金を次年度に使用する。本年度の研究計画がやや遅れた部分は、次年度中に追い付いて遅れを取り戻すことが可能であり、平成26年度からの持ち越し分が加わる以外、平成27年度及び28年度の研究計画及び使用計画にはあまり変更はない。
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