2015 Fiscal Year Annual Research Report
HIV-1個体内複製と病原性に関する基礎研究：アクセサリー蛋白質の機能解析
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26293104
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
足立 昭夫 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (90127043)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野間口 雅子 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 准教授 (80452647)
宮崎 恭行 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 助教 (70607233) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ウイルス / HIV-1 / SIV / HIV-1rmt / アクセサリー蛋白質 / アカゲザル / 抗HIV-1因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
HIV-1は宿主域が狭く適切な動物モデルが存在しない。このため、個体内ウイルス複製機構や病原性発現機構解明等の基礎研究、さらに、新規抗エイズ戦略開発等の臨床応用研究の推進が著しく困難となっている。研究代表者らはこの課題の克服に向け、抗HIV-1細胞因子に抵抗性を示す一連のアカゲザル指向性HIV-1 (HIV-1rmt)の作製に取組み、末梢血単核細胞(PBMC)において病原性SIV標準クローン(SIVmac239)と同等に複製するCXCR4細胞指向性HIV-1rmtクローン(MN4/LSDQgtu)の構築に世界で初めて成功した。MN4/LSDQgtuはアカゲザル個体でも再現性良く増殖するが、SIVmac239より増殖能は劣り病原性は示さなかった。感染個体にエイズを発症させるファウンダーウイルスはCCR5細胞指向性であるので、本年度はMN4/LSDQgtuを出発材料に様々の手法を用いてこの特性を持つHIV-1rmtの構築に特に注力した。その結果、アカゲザル細胞に感染性を示す4種類のCCR5細胞指向性HIV-1rmtクローンの作出に成功した。とりわけ、gtu+A4Y1と命名されたプロウイルスクローンはアカゲザルPBMC中でMN4/LSDQgtuと同等レベルで増殖した。注目すべきことに、このクローンはHIV-1の臨床分離株由来のEnvを持つ。さらに、ウイルス複製能の向上に寄与すると報告されている種々のGag変異やEnv変異をこれら4種類のクローンに導入したが、明確な効果は認められなかった。現在、アカゲザル細胞におけるウイルス馴化を試みている。これと並行して、アクセサリー蛋白質の欠損体/変異体の作製を進めている。以上の成績はHIV-1の個体内複製機構や病原性発現機構を解析する上で重要な材料を提供する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
HIV-1は高度にヒトに特化したウイルスであるが、この特性を担うのは主としてアクセサリー蛋白質である。種々のSIV/HIVは特有の組み合わせのアクセサリー蛋白質を有し、HIV-1もアクセサリー蛋白質として固有のVif、Vｐr、VpuおよびNefをコードしている。分子・細胞レベルにおけるHIV-1アクセサリー蛋白質の研究は非常な勢いで進展したが、感染個体におけるウイルス複製動態やエイズ発症機構を実験的に解析するため、これまでに様々な動物モデル（ヒト化マウスや霊長類等）が提唱されている。感染実験用ウイルスとしては、SIVmac、SIVmacをベースにしたSIV/HIV-1遺伝子組換えウイルスSHIVが頻繁に用いられている。それぞれの系には一長一短があるが、HIV-1がヒトに特化したウイルスであること、また、ウイルス特異的アクセサリー蛋白質の存在を考えると、できる限りHIV-1そのものを使用する実験系が望ましいと思われる。多くの研究者の研究成果から、発症実験動物モデルとしてはアカゲザルが最も適していると考えられる。本研究は、HIV-1rmtクローンMN4/LSDQgtuを基に、HIV-1の個体内複製とその病原性発現機構の実験的解明を目指し、アカゲザル細胞・個体を用いたアクセサリー蛋白質群の系統的機能解析を行うものである。これまでに、MN4/LSDQgtuがアカゲザル個体で再現性良く増殖するHIV-1rmtであることを実証した。さらに、gtu+A4Y1がアカゲザルPBMCにおいてMN4/LSDQgtuと同等に増殖し得ることが明らかになった。これにより、gtu+A4Y1がアカゲザル個体感染実験に使用可能であり、アクセサリー蛋白質の欠損体/変異体解析の出発材料として有用であることが示された。これらを総合して考えると、本研究はおおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）CCR5細胞指向性HIV-1rmtクローンであるgtu+A4Y1（本研究で構築した臨床分離株由来env遺伝子を持つクローン）はアカゲザルPBMCにおいてCXCR4細胞指向性MN4/LSDQgtuと同様に増殖する。gtu+A4Y1の細胞レベル及び個体レベルの増殖特性を長期に亘り観察し、馴化能や病原性について解析する。gtu+A4Y1の単一感染だけでなく、他のCCR5細胞指向性HIV-1rmtクローンとの混合感染も試み、同様の解析を行う。
（２）HIV-1アクセサリー蛋白質のアカゲザル個体内複製における役割を検討するため、gtu+A4Y1の4種のアクセサリー遺伝子についてそれぞれ欠損体/変異体を作製し、その細胞レベル及び個体レベルの複製能を解析する。個体を用いる解析においては、復帰変異の有無について特に注意する。
（３）アカゲザルに病原性を示すウイルスが得られれば、分子クローン化する。このクローンから各種のアクセサリー遺伝子欠損体/変異体を作製し、アカゲザル個体でのウイルス複製能・病原性発現能とアクセサリー蛋白質との関係を検証する。復帰変異の有無について注意して解析する。
（４）抗HIV-1細胞因子遺伝子多型とHIV-1rmt複製・病原性との相関を解析する。できる限り多くのアカゲザル個体からPBMCを調整し、HIV-1細胞因子(TRIM5蛋白質群、APOBEC3蛋白質群及びTetherin)をコードする遺伝子の塩基配列を決定する。
（５）アカゲザル個体内におけるウイルス変異を解析する。ウイルス感染個体から経時的にサンプル（血漿やリンパ節等）を採取し、ウイルス遺伝子の塩基配列を決定する。まず、ヒトでの情報が集積している構造遺伝子について解析し、ついで、アクセサリー遺伝子の変異について解析する。得られた結果をHIV-1/ヒト自然感染での成績と比較検討する。
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| Causes of Carryover |
購入したアカゲザルからPBMCを調製してHIV-1rmtに対する感受性を調べたところ、極めて抵抗性であるサルが見つかった。このこと自体はウイルス学的に興味深く、プロジェクトの課題として抵抗性の原因を検討している。しかしながら、平成27年度に予定していた個体感染実験用の頭数が確保できないこととなった。このため、予定していた個体感染実験経費を平成28年度のアカゲザル購入・飼育費用に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究期間の最終年である平成28年度は可能な限り多数のアカゲザルを使用する予定である。サル購入費に加え、平成28年度からは京大ウイルス研でのサルの飼育に新たに経費が必要になるということである。これらの経費に繰り越し分を充てる。当初から平成28年度に予定していたアカゲザル個体感染実験以外の実験研究は計画通りに実施する。これらにより、本研究を着実に進展させ目標達成を目指す。
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[Journal Article] Natural single-nucleotide variations in the HIV-1 genomic SA1prox region can alter viral replication ability by regulating Vif expression levels.2016
Author(s)
Nomaguchi, M., Doi, N., Sakai, Y., Ode, H., Iwatani, Y., Ueno, T., Matsumoto, Y., Miyazaki, Y., Masuda, T., and Adachi, A.
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Journal Title
Journal of Virology
Volume: 90
Pages: 4563-4578
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Novel mutant human immunodeficiency virus type 1 strains with high degree of resistance to cynomolgus macaque TRIMCyp generated by random mutagenesis.2016
Author(s)
Sultana, T., Nakayama, E.E., Tobita, S., Yokoyama, M., Seki, Y., Saito, A., Nomaguchi, M., Adachi, A., Akari, H., Sato, H., and Shioda, T.
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Journal Title
Journal of General Virology
Volume: 97
Pages: 963-976
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] In silico analysis of HIV-1 Env-gp120 reveals structural bases for viral adaptation in growth-restrictive cells.2015
Author(s)
Yokoyama, M., Nomaguchi, M., Doi, N., Kanda, T., Adachi, A., and Sato, H.
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Journal Title
Frontiers in Microbiology
Volume: 7
Pages: article 110
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Novel mutant human immunodeficiency virus type 1 strains with high degree of resistance to cynomolgus macaque TRIMCyp generated by random mutagenesis.2016
Author(s)
Sultana, T., Nakayama, E.E., Tobita, S., Yokoyama, M., Seki, Y., Saito, A., Nomaguchi, M., Adachi, A., Akari, H., Sato, H., Shioda, T.
Organizer
The 23rd Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections
Place of Presentation
Boston, USA
Year and Date
2016-02-22 – 2016-02-25
Int'l Joint Research
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[Presentation] Novel mutant HIV-1 strains with high degree of resistance to cynomolgus macaque TRIMCyp generated by random mutagenesis.2015
Author(s)
Sultana, T., Nakayama, E.E., Tobita, S., Saito, A., Nomaguchi, M., Adachi, A., Akari, H., Shioda, T.
Organizer
The 63rd Annual Meeting of The Japanese Society for Virology
Place of Presentation
Fukuoka International Congress Center (Fukuoka, Fukuoka)
Year and Date
2015-11-22 – 2015-11-24
