アルポート症候群の分子治療法の確立

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293203
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 飯島 一誠 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00240854)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野津 寛大 神戸大学, 医学部附属病院, 講師 (70362796)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: アルポート症候群 / 分子治療 / アンチセンスオリゴヌクレオチド / エクソンスキッピング

Outline of Annual Research Achievements

X染色体連鎖性アルポート症候群（XLAS）はIV型コラーゲンα5鎖をコードするCOL4A5遺伝子の変異で発症し、男性患者の大半は40歳までに末期腎不全に進行する予後不良な遺伝性腎疾患である。5000人に1人という比較的高頻度で発症するが、現在のところ有効な治療法はない。我々はこれまで200家系を超えるXLASの遺伝子型―表現型解析を行った結果、ナンセンス変異やフレームシフト変異などの“Truncating変異”では、“非Truncating変異”に比して腎不全への進行が早いことを明らかにした。本研究は、リードスルーやエクソンスキッピングなどを誘導し、予後不良な“Truncating変異”を比較的予後良好な“非Truncating変異”に修復することを目指すものであり、世界で初めて、XLASの分子治療法を確立することを目的とする。
今年度は、日本人XLASで比較的多く変異の認められるエクソンを検討し、複数のエクソンをターゲットとして、種々のENAアンチセンスオリゴヌクレオチド(ENA-ASO)のエクソンスキッピング誘導活性を検討し、最も活性の高いENA-ASNを同定した。また、正常マウスにおいて、ENA ASOが尿細管とポドサイトに取り込まれることを確認した。また平成26年度の研究で、患者尿中落下細胞に腎幹細胞が存在することを確認したが、今年度はその特徴をより詳細に解析するとともに、ポドサイトへの分化誘導研究を遂行中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

我々が現在まで収集したXLAS患者のデータベースをより詳細に解析し、比較的変異症例の多いエクソンを抽出するとともに、そのエクソンを対象として、種々のENA-ASNのエクソンスキッピング誘導活性を検討し、最も活性の高いENA-ASOを同定した。また、将来の臨床応用のためには、ENA-ASOが腎構成細胞、特にIV型コラーゲンα5鎖を発現・産生すると考えられるポドサイト及び尿細管上皮細胞に取り込まれるin vivoで確認する必要があるが、正常マウスにENA-ASOを投与したところ、期待したとおりに、ポドサイト及び尿細管上皮細胞に取り込まれることを確認した。我々は、研究の過程で、患者尿中落下細胞中に腎幹細胞が存在することを確認し、現在、その特徴をより詳細に解析するとともに、尿中腎幹細胞からポドサイトへの分化誘導を試みている。
以上より、おおむね当初の計画どおりに進展している。

Strategy for Future Research Activity

１）XLAS患者の遺伝子情報の蓄積：神戸大学小児科ではこれまで約300例のアルポート症候群患者で遺伝子診断を行ってきた。今後、引き続き情報を集積し、今後の分子生物学的治療の候補となる患者情報の集積を行う。なお、最近、次世代シークエンサーによるパネル解析を用いた方が、より効率よくAlport症候群の診断が可能となることが明らかになり、現在、その導入を進めている。
２）Alportモデルマウスにおいて、ENA-ASOが糸球体podocyteに取り込まれることの確認： Alportモデルマウスにおいて蛍光ラベルで標識したENA-ASOを投与し、腎臓摘出後凍結切片を作成し、nephrinまたはpodocin、WT1等と二重染色する。それによりENA-ASOが糸球体ポドサイトに取り込まれることを確認する。
３）患者由来糸球体podocyteおよび尿細管上皮細胞の培養、患者由来iPS細胞からの3次元腎組織誘導及びENA-ASOを用いたエクソンスキッピング療法によるalpha5(IV)の発現解析：患者の尿より落下細胞 (糸球体podocyte及び尿細管上皮細胞) を収集し培養を行う。また、患者由来iPS細胞からの3次元腎組織を誘導する。それらに対し、ENA-ASOを投与し、エクソンスキッピングおよび5(IV)蛋白の発現を認めるかにつき検討を行う。対象は先に示した表で3の倍数の塩基数を有するエクソンにナンセンス変異またはフレームシフト変異を有する患者である。
４）In vivoでの治療効果の判定：Truncating変異を有する動物モデルを作成し、上記の治療法の効果を検討する。

Research Products

• [Journal Article] Genetic, clinical and pathological backgrounds in autosomal dominant Alport syndrome. (2016)
  • Author(s): Kamiyoshi N, Nozu K, Fu XJ, Morisada N, Nozu Y, Imafuku A, Miura K, Yamamura T, Minamikawa S, Shono A, Ninchoji T, Kaito H, Morioka I, Nakanishi K, Yoshikawa N, Iijima K.
  • Journal Title: Clin J Am Soc Nephrol. Volume: 11 Pages: in press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of mutations in FN1 leading to glomerulopathy with fibronectin deposits. (2016)
  • Author(s): Ohtsubo H, Okada T, Nozu K, Takaoka Y, Shono A, Asanuma K, Zhang L, Nakanishi K, Taniguchi-Ikeda M, Kaito H, Iijima K, Nakamura SI
  • Journal Title: Pediatr Nephrol. Volume: 58 Pages: April 07 Epub
  • DOI: 10.1007/s00467-016-3368-7
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rare renal ciliopathies in non-consanguineous families that were identified by targeted resequencing. (2016)
  • Author(s): Yamamura T, Morisada N, Nozu K, Minamikawa S, Ishimori S, Toyoshima D, Ninchoji T, Yasui M, Taniguchi-Ikeda M, Morioka I, Nakanishi K, Nishio H, Iijima K.
  • Journal Title: Clin Exp Nephrol. Volume: 20 Pages: March 11 Epub
  • DOI: 10.1007/s10157-016-1256-x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] New-onset diabetes after renal transplantation in a patient with a novel HNF1B mutation. (2016)
  • Author(s): Kanda S, Morisada N, Kaneko N, Yabuuchi T, Nawashiro Y, Tada N, Nishiyama K, Miyai T, Sugawara N, Ishizuka K, Chikamoto H, Akioka Y, Iijima K, Hattori M.
  • Journal Title: Pediatr Transplant. Volume: 20 Pages: 467-471
  • DOI: 10.1111/petr.12690.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Next-generation sequencing discloses a nonsense mutation in the dystrophin gene from long preserved dried umbilical cord and low-level somatic mosaicism in the proband mother. (2016)
  • Author(s): Taniguchi-Ikeda M, Takeshima Y, Lee T, Nishiyama M, Awano H, Yagi M, Unzaki A, Nozu K, Nishio H, Matsuo M, Kurahashi H, Toda T, Morioka I, Iijima K.
  • Journal Title: J Hum Genet. Volume: 61 Pages: Jan 7 Epub
  • DOI: 10.1038/jhg.2015.157.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Combined Alport syndrome and Klinefelter syndrome. (2016)
  • Author(s): Nishida M, Hashimoto F, Kaito H, Nozu K, Iijima K, Asada D, Hamaoka K.
  • Journal Title: Pediatr Int. Volume: 58 Pages: 152-155
  • DOI: 10.1111/ped.12743.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Insignificant impact of VUR on the progression of CKD in children with CAKUT. (2016)
  • Author(s): Ishikura K, Uemura O, Hamasaki Y, Nakai H, Ito S, Harada R, Hattori M, Ohashi Y, Tanaka R, Nakanishi K, Kaneko T, Iijima K, Honda M; Pediatric CKD Study Group in Japan in conjunction with the Committee of Measures for Pediatric CKD of the Japanese Society for Pediatric Nephrology.
  • Journal Title: Pediatr Nephrol. Volume: 31 Pages: 105-112
  • DOI: 10.1007/s00467-015-3196-1.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Risk factors for relapse and long-term outcome in steroid-dependent nephrotic syndrome treated with rituximab. (2016)
  • Author(s): Kamei K, Ogura M, Sato M, Sako M, Iijima K, Ito S.
  • Journal Title: Pediatr Nephrol. Volume: 31 Pages: 89-95
  • DOI: 10.1007/s00467-015-3197-0.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pathogenesis of hypokalemia in autosomal dominant hypocalcemia type 1. (2016)
  • Author(s): Kamiyoshi N, Nozu K, Urahama Y, Matsunoshita N, Yamamura T, Minamikawa S, Ninchoji T, Morisada N, Nakanishi K, Kaito H, Iijima K.
  • Journal Title: Clin Exp Nephrol. Volume: 20 Pages: 253-257
  • DOI: 10.1007/s10157-015-1160-9.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Somatic mosaicism and variant frequency detected by next-generation sequencing in X-linked Alport syndrome. (2016)
  • Author(s): Fu XJ, Nozu K, Kaito H, Ninchoji T, Morisada N, Nakanishi K, Yoshikawa N, Ohtsubo H, Matsunoshita N, Kamiyoshi N, Matsumura C, Takagi N, Maekawa K, Taniguchi-Ikeda M, Iijima K.
  • Journal Title: Eur J Hum Genet. Volume: 24 Pages: 387-391
  • DOI: 10.1038/ejhg.2015.113.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Differential diagnosis of Bartter syndrome, Gitelman syndrome, and pseudo-Bartter/Gitelman syndrome based on clinical characteristics. (2016)
  • Author(s): Matsunoshita N, Nozu K, Shono A, Nozu Y, Fu XJ, Morisada N, Kamiyoshi N, Ohtsubo H, Ninchoji T, Minamikawa S, Yamamura T, Nakanishi K, Yoshikawa N, Shima Y, Kaito H, Iijima K.
  • Journal Title: Genet Med. Volume: 18 Pages: 180-188
  • DOI: 10.1038/gim.2015.56.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] X-linked Alport syndrome associated with a synonymous p.Gly292Gly mutation alters the splicing donor site of the type IV collagen alpha chain 5 gene. (2015)
  • Author(s): Fu XJ, Nozu K, Eguchi A, Nozu Y, Morisada N, Shono A, Taniguchi-Ikeda M, Shima Y, Nakanishi K, Vorechovsky I, Iijima K
  • Journal Title: Clin Exp Nephrol. Volume: 20 Pages: Nov 18 Epub
  • DOI: 10.1007/s10157-015-1197-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biallelic Mutations in Nuclear Pore Complex Subunit NUP107 Cause Early-Childhood-Onset Steroid-Resistant Nephrotic Syndrome. (2015)
  • Author(s): Miyake N, Tsukaguchi H, Koshimizu E, Shono A, Matsunaga S, Shiina M, Mimura Y, Imamura S, Hirose T, Okudela K, Nozu K, Akioka Y, Hattori M, Yoshikawa N, Kitamura A, Cheong HI, Kagami S, Yamashita M, Fujita A, Miyatake S, Tsurusaki Y, Nakashima M, Saitsu H, Ohashi K, Imamoto N, Ryo A, Ogata K, Iijima K, Matsumoto N.
  • Journal Title: Am J Hum Genet. Volume: 97 Pages: 555-566
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2015.08.013.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Long-term outcome of childhood IgA nephropathy with minimal proteinuria. (2015)
  • Author(s): Higa A, Shima Y, Hama T, Sato M, Mukaiyama H, Togawa H, Tanaka R, Nozu K, Sako M, Iijima K, Nakanishi K, Yoshikawa N.
  • Journal Title: Pediatr Nephrol. Volume: 30 Pages: 2121-2127
  • DOI: 10.1007/s00467-015-3176-5.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rituximab Treatment for Nephrotic Syndrome in Children. (2015)
  • Author(s): Iijima K, Sako M, Nozu K.
  • Journal Title: Curr Pediatr Rep. Volume: 3 Pages: 71-77
  • DOI: 10.1007/s40124-014-0065-5
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 教育講演 小児腎疾患診療における遺伝学的アプローチ (2015)
  • Author(s): 飯島一誠，森貞直哉，野津寛大
  • Organizer: 第37回日本小児腎不全学会学術集会
  • Place of Presentation: 石川
  • Year and Date: 2015-11-26 – 2015-11-27
  • Invited
• [Presentation] Somatic Mosaicism and Variant Frequency Detected by Next Generation Sequencing in X Linked Alport Syndrome. (2015)
  • Author(s): Kamiyoshi N, Nozu K, Fu X.J, Yamamura T, Minamikawa S, Ninchoji T, Iijima K.
  • Organizer: Kidney Week 2015
  • Place of Presentation: San Diego Convention Center (San Diego, U.S.A.)
  • Year and Date: 2015-11-03 – 2015-11-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Comprehensive Approach to Understand Human Renal Development Based on the Identification of Responsible Genes for CAKUT. (2015)
  • Author(s): Shono A, Morisada N, Nozu K, Iijima K.
  • Organizer: Kidney Week 2015
  • Place of Presentation: San Diego Convention Center (San Diego, U.S.A.)
  • Year and Date: 2015-11-03 – 2015-11-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Genital Organ Anomalies in Female Pediatric Patients with End-Stage Renal Disease. (2015)
  • Author(s): Kanda S, Morisada N, Tomii Y,Takizawa K, Kaneko N, Yabuuchi T, Hama H, Nakano E, Tada N, Ishizuka K, Akioka Y, Chikamoto H, Iijima K, Hattori M.
  • Organizer: Kidney Week 2015
  • Place of Presentation: San Diego Convention Center (San Diego, U.S.A.)
  • Year and Date: 2015-11-03 – 2015-11-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] A Family Case of Hypoparathyroidism, Deafness, and Renal Dysplasia Syndrome with a Novel Mutation of GATA3. (2015)
  • Author(s): Yabuuchi T, Kanda S, Morisada N, Takizawa K, Tomii Y, Kaneko N, Hama H, Nakano E, Tada N, Ishizuka K, Chikamoto H, Akioka Y, Iijima K, Hattori M.
  • Organizer: Kidney Week 2015
  • Place of Presentation: San Diego Convention Center (San Diego, U.S.A.)
  • Year and Date: 2015-11-03 – 2015-11-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] New-Onset Diabetes After Transplantation in a Pediatric Patient with Congenital Anomalies of the Kidney and Urinary Tract: The Role of Hepatocyte Nuclear Factor 1β. (2015)
  • Author(s): Kaneko N, Morisada N,Takizawa K, Yabuuchi T, Hama H,Tada N, Nakano E, Kanda S, Ishizuka K, Chikamoto H, Akioka Y, Iijima K, Hattori M.
  • Organizer: Kidney Week 2015
  • Place of Presentation: San Diego Convention Center (San Diego, U.S.A.)
  • Year and Date: 2015-11-03 – 2015-11-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ワークショップ１ 腎炎・ネフローゼ症候群の治療トピックス 難治性ネフローゼ症候群に対するリツキシマブ治療 (2015)
  • Author(s): 飯島一誠，野津寛大，佐古まゆみ
  • Organizer: 第45回日本腎臓学会西部学術大会
  • Place of Presentation: 金沢
  • Year and Date: 2015-10-23 – 2015-10-24
  • Invited
• [Presentation] Genetic, pathological and clinical backgrounds in autosomal dominant Alport syndrome. (2015)
  • Author(s): Nozu K, Kamiyoshi N, Matsunoshita N, Minamikawa S, Yamamura T, Ninchoji T, Tanaka R, Nakanishi K, Yoshikawa N, Iijima K.
  • Organizer: 48th Annual Scientific Meeting of the European Society for Pediatric Nephrology
  • Place of Presentation: Square Brussels Meeting Centre (Brussels, Belgium)
  • Year and Date: 2015-09-03 – 2015-09-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 会長講演 小児特発性ネフローゼ症候群－新たな治療戦略と今後の課題－ (2015)
  • Author(s): 飯島一誠
  • Organizer: 日本小児腎臓病学会学術集会 第50回記念大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-06-18 – 2015-06-20
  • Invited
• [Presentation] 常染色体優性Alport症候群における遺伝学的背景および臨床的、病理学的検討 (2015)
  • Author(s): 神吉直宙，野津寛大，南川将吾，山村智彦，松野下夏樹，大坪裕美，忍頂寺毅史，貝藤裕史，飯島一誠
  • Organizer: 日本小児腎臓病学会学術集会 第50回記念大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-06-18 – 2015-06-20
• [Presentation] 常染色体優性Alport症候群の遺伝学的背景と臨床像 (2015)
  • Author(s): 神吉直宙，野津寛大，南川将吾，山村智彦，松野下夏樹，大坪裕美，忍頂寺毅史，貝藤裕史，飯島一誠
  • Organizer: 第58回日本腎臓学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2015-06-05 – 2015-06-07
• [Presentation] よくわかるシリーズ７ 小児ネフローゼ症候群の治療 リツキサン (2015)
  • Author(s): 飯島一誠
  • Organizer: 第58回日本腎臓学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2015-06-05 – 2015-06-07
  • Invited
• [Book] ネフローゼ症候群（ステロイド感受性）小児科診療ガイドライン－最新の診療指針－第3版 （編集：五十嵐隆） (2016)
  • Author(s): 飯島一誠
  • Total Pages: 670 (365-369)
  • Publisher: 総合医学社