2014 Fiscal Year Annual Research Report
肺腺癌浸潤における癌幹細胞の役割についてのiPS細胞技術を用いた研究
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26293317
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Research Institution | Kobe University |
Principal Investigator |
眞庭 謙昌 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50362778)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
青井 貴之 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00546997)
林 祥剛 神戸大学, 保健学研究科, 教授 (50189669)
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Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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Keywords | 肺癌 / 発生・分化 / バイオテクノロジー / トランスレーショナルリサーチ / 癌幹細胞 |
Outline of Annual Research Achievements |
[目的] iPS細胞技術を応用して原発性肺癌細胞株より、癌幹細胞性を有する細胞の誘導を行う。誘導された細胞を用いる解析により、肺腺癌の浸潤部位形成と伸展機序を解明し、制御法を確立することを目的とする。 [方法] レトロウイルスベクターを用いて、代表的な原発性肺癌細胞株であるA549細胞に体細胞初期化因子(Oct 3/4, Sox2, Klf4)の導入を行う。そしてそれによる形態的変化、細胞増殖能の変化、細胞周期の解析、Sphere形成能の比較、E-cadherinの発現評価、Double-layered collagen gel hemisphere(DL-CGH)法による浸潤能の評価を行い、癌幹細胞としての性質を評価する。 [結果] 体細胞初期化因子を導入したA549細胞(OSK-A549)において、遺伝子導入後10日~15日目に核/細胞質比の高い小型の細胞からなるコロニーの出現を認めた。細胞増殖能はOSK-A549細胞において低下していた。誘導されたコロニーの細胞周期を解析したところ、G0/G1期の細胞を多く認めた。またSphere形成能は、OSK-A549細胞において、著明に高かった。OSK-A549細胞において、qRT-PCR法でE-cadherinの発現低下を認め、DL-CGH法において、OSK-A549細胞は高い浸潤能を示した。 [結論]本実験系により、肺癌幹細胞様の細胞を誘導できると考えられた。その細胞の解析により、肺腺癌の浸潤部位形成と進展機序の解明につながる可能性が示唆された。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々は本研究にて、体細胞初期化因子を導入したOSK-A549において、遺伝子導入後10~15日にコロニーが出現し、誘導された細胞の癌幹細胞性の評価を行った。まず細胞増殖能に関して、OSK-A549細胞において、細胞増殖能の低下を認めている。これは遺伝子導入によりdormantな状態の癌幹細胞が誘導され、全体として増殖能が落ちていると考えられる。さらにCell cycle assayを用いた細胞周期解析により、誘導されたColonyにおいて、G0/G1期の細胞が多く存在していることが確認され、このことも癌幹細胞性を獲得した細胞が誘導されたことを示唆する所見である。癌幹細胞性の評価として用いられるSphere formation assay を用いた解析では、OSK-A549細胞においてのみ、著明なSphere形成能の上昇を認めている。以上の結果から、体細胞初期化因子の導入により、肺癌幹細胞様の細胞が得られると考えられる。 26年度は肺癌幹細胞様細胞の作成法の確立を計画し順調に達成しており、現時点で、すでに27年度の計画に取り掛かっており、上記の区分に相当すると考える。
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Strategy for Future Research Activity |
肺腺癌細胞由来の癌幹細胞のフローサイトメトリーを用いた癌幹細胞の選択的回収、その機能解析を行う。上記により回収された細胞のRNA を抽出・精製し、得られたRNA をマイクロアレイによって解析し、癌幹細胞様特性獲得に関与する遺伝子の候補を抽出する。これらの遺伝子の中から、癌幹細胞の特性獲得に関与するものとして有力と考えられる遺伝子(群)を絞り込む。具体的には、遺伝子群の機能解析を細胞生物学的手法すなわち強制発現やノックダウンによる機能喪失実験によって行うことでこれらの遺伝子が癌幹細胞特性獲得に関与しているか否かを明らかにする。さらに癌幹細胞の性質獲得に重要と確認された遺伝子(群)の肺腺癌臨床検体における発現の有無を、免疫組織化学染色法を用いて調べ、癌細胞内での発現及び局在を確認する。またそれらの遺伝子の発現の有無と予後との相関を明らかにする。これにより、臨床検体における肺腺癌幹細胞マーカーを確立する。そして、その中での喫煙により体内に取り込まれる各種のケミカルメディエーターの影響について検討していく。
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Causes of Carryover |
少額の研究費が残り、研究を進めるための適切な消耗品購入には不適当であったため、次年度に繰り越した上で、必要物品の購入に当てることとした。
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Expenditure Plan for Carryover Budget |
iPS技術を用いた肺癌幹細胞様細胞を得るための試薬購入に当てる。
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