細胞骨格制御因子をターゲットとした創傷治癒機構の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26293380
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 久保 盾貴 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00362707)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 細川 亙 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20181498) ; 金澤 成行 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (50506243) ; 河合 建一郎 兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (80423177)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 皮膚線維芽細胞 / 筋線維芽細胞 / Rhoファミリー低分子量G蛋白質

Outline of Annual Research Achievements

皮膚線維芽細胞を用いて細胞骨格制御因子の活性化を観察した。Rhoファミリー低分子量G蛋白質のなかでも、RhoAに着目し解析を行った。
まずTGF-βを用いて、皮膚線維芽細胞が筋線維芽細胞へ、文献通りに分化するかを確認した。real time PCR、ウエスタンブロッティング、免疫染色法を用いて、筋線維芽細胞のマーカーであるα-SMAの発現を確認したところ、TGF-β刺激では皮膚線維芽細胞はかなりの高率で筋線維芽細胞へ分化することを確認できた。
そこで、皮膚線維芽細胞をTGF-βで筋線維芽細胞に分化させ、その時のRhoAの活性化を測定したところ、皮膚線維芽細胞は筋線維芽細胞への分化時RhoAを活性化させることが判明した。次に、RhoAシグナルの下流にあるRho-kinaseの阻害薬であるY-27632を添加したところ、TGF-βを添加しても皮膚線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化が抑制された。そのため、皮膚線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化にRhoAが関与することが判明した。
次の段階として、ストレックス社製の培養細胞伸展システム（ストレッチチャンバー）を用いて、皮膚線維芽細胞に伸展刺激を加えた場合の筋線維芽細胞への分化を観察した。伸展刺激を加えた場合、皮膚線維芽細胞は筋線維芽細胞へ分化誘導されることをreal time PCR、ウエスタンブロッティング、免疫染色法で確認できた。また、伸展刺激により皮膚線維芽細胞が筋線維芽細胞へ分化誘導されるときに、RhoAが活性化することも判明した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究の根底をなすRhoAの活性化を観察するためのアッセイの結果にばらつきがみられた。そのため、そのアッセイの再現性を獲得するために様々な手法を繰り返し試す必要があり、そこに非常に時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、平成26年度の後半に解析を予定していた分化した筋線維芽細胞のアポトーシスにRhoファミリー低分子量G蛋白質が関与するのかを重点的に解明していく予定である。

Causes of Carryover

研究の進行が予定より遅れた分、本来行う実験が遂行できず、次年度使用額を生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成27年度で後れを取り戻す予定であり、当初の研究分と遅れの分を合わせ分の研究費の支出を要する見込みである。