2015 Fiscal Year Research-status Report
新規APエンドヌクレアーゼAPNXのアセチル基転移活性とTip60活性化の解明
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26340020
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Research Institution | Tohoku University |
Principal Investigator |
菅野 新一郎 東北大学, 加齢医学研究所, 講師 (10400417)
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Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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Keywords | DNA修復 / 酸化ストレス / アセチルトランスフェラーゼ |
Outline of Annual Research Achievements |
ゲノムの安定性にかかわるDNA修復機構に関連した研究を行いDNA二重鎖切断のDNA修復機構に関連するタンパク質であるPNKPとAPTXの もつFHA domainの解析からNHEJに関わる新規DNA修復酵素(PALF)を発見した。PALFがPARP1と相互作用しPARP1を活性化すること、また、P ALFのタンパク質配列のバイオインフォマティクス解析から新規CYR domainを発見した(EMBO J. 2007; 26, 2094-2103, J Biol Chem. 2011; 286: 36368 -77)。 CYR domain の構造を決定し、poly ADP ribosyl鎖に結合することを明らかにした(Genes Cells. 2010 ; 15:101-10)。CYR domainを含むタンパク質CG1218とそのヒトオスソログC4orf27( APNX) を解析し、PALF (APLF)とよく似たAP endonuclease 活性、3’-exonuclease活性を持つことを明らかにした。新規に見いだしたC4orf27は細胞核とくに核小体に分布している。また、核小体はoxidative stress sensorとして機能していることが知られており、核小体には塩基除去修復関連タンパク質が多く分布することが知られている。そこでAPNXと塩基除去修復酵素POLBとの関係を調べていたが、その過程でPOLBが核だけではなくミトコンドリアにも分布し機能していることを見いだした(投稿中)。また、ミトコンドリアの活性化状態とミトコンドリアゲノムのDNA修復機構を調べるために新規に見いだされたミトコンドリア活性化剤MA-5を使ってミトコンドリアのヌクレオイドを解析した(J Am Soc Nephrol. 2015 pii: ASN.2015060623)。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究の進展として、(1)新たにAPNXのリコンビナントタンパク質をバキュロを用いた系で大量に作成できるようになった。バキュロで作成したリコンビナントタンパク質はヒトに近い翻訳後修飾を受けている。そこでこのBcGST-APNX affinity columnを用いて結合タンパク質を解析した。その結果、新たにSPTH16, HNRNPC, H2AZが相互作用タンパク質として同定された。(2)APNXはAP endonuclease 活性とアセチル転移酵素活性を持っているが、アセチル転移酵素としての基質はTip60以外はよく分かっていない。そこで弱い結合の相互作用タンパク質でも同定が可能なBioIDのテクニックを使うため、T-REXベクターに大腸菌の変異ビオチン転移酵素 ( BirA* )と2種類のリンカーを使って4種類のベクターを作成した。この4つのベクターにAPNXを導入し、in vivoで相互作用タンパク質をビオチン化ラベルし同定する系を確立した。
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Strategy for Future Research Activity |
APNXはPARP1と複合体を形成し細胞核とくに核小体に分布している。また、APNXのノックダウンでは酸化ストレスに感受性になることを見いだしている。以前から核小体はoxidative stress sensorとして機能していると考えられており、核小体には塩基除去修復関連タンパク質をはじめとするが多くの酸化ストレスに関係するタンパク質が分布することが知られている。バキュロを使って作成したAPNX affinity columnの結果からAPNXはFACTのSPTH16と結合することが明らかになった。FACTはTip60によるアセチル化によって制御されていることが知られており、また、核小体でoxidative stress sensor proteinとして機能することが報告されている。以上のことを考えるとAPNXの生理的機能の解析にはAPNXの核小体での役割の解明が重要であることが示唆される。そこで、今後の研究として、(1)樹立したFlag-APNX発現細胞、Flag-SPTH16発現細胞、Flag-Tip60発現細胞を使って核小体との関連を調べる。 (2)大腸菌の変異ビオチン転移酵素 ( BirA* )を使ったBioIDテクニックを用いてin vivoで核小体の相互作用タンパク質をビオチン化ラベルし同定解析する。これらのデータを解析した上でアセチル転移酵素としてのAPNXの役割をまとめる予定である。
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Research Products
(2 results)