2014 Fiscal Year Research-status Report
嫌気性菌による難分解性バイオマスからの水素ガス生産システムの開発
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26340100
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
木村 哲哉 三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (00281080)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Clostridium / 水素ガス / 嫌気性菌 / 乳酸デヒドロゲナーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
嫌気性細菌Clostridium paraputrificum M21株の水素ガス生産において、すでに以前の研究で鉄を培地に添加することで、水素ガスの生産が約1.5倍以上増えることを見いだしていた。そこで、鉄の濃度や培養条件の至適化を試みた。これまでジャーファメンターを用いた実験では、冷凍保存した菌体を解凍し、前々培養、前培養とスケールアップを繰り返して本培養実験を行う必要があった。しかし、前培養条件によって菌体の増殖速度と水素ガス生産がばらつくことが多く、実用的な培養を考えるとこのような方法では労力の点からも問題となっていた。そこで、一度に大量に冷凍した菌体を直接本培養に持って行くことで、前培養条件によるばらつきをなくせないか嫌気培養瓶で実験を行ったところ、増殖の立ち上がりは遅くなるが、その後の増殖のピークと水素ガス生産には影響がないことがわかった。また、詳細な培地条件、特に鉄濃度についても検討を行い、水素ガス増産にはわずかな鉄（１Ｌ当たり数ミリグラム）でも十分であることを突き止めた。鉄を加えた条件での有機酸の生産を調べたところ、乳酸の生産が減少し酪酸と酢酸が増加していたことから、乳酸の生産を押さえることが水素ガス生産には重要であることが予測された。ゲノム配列の解析から、解凍系から酢酸や酪酸を生産する遺伝子群については予測ができていたが、これらの発現については不明であったため、これらがどのような強度で発現しているか、次世代シークエンサーによるRNA-seqを行って解析をした。その結果、解凍系からピルビン酸を経て酢酸や酪酸を生産するほとんど遺伝子が高発現していることがわかった。乳酸デヒドロゲナーゼをコードすると予測された２つの遺伝子のうち一方のみが高発現しており、この遺伝子の発現を押さえることができれば水素ガス生産を増加させることができるのではないかと予測された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画では、培養条件の詳細な検討、遺伝子工学による代謝工学、セルロース分解性嫌気性細菌の遺伝子改変、セルロース分解性嫌気性細菌と水素ガス生産嫌気性細菌の共存培養を行う予定であったが、培養条件の検討と代謝工学に必要な遺伝子の発現状況確認までしか進めることができなかった。嫌気性細菌の遺伝子工学、とくに遺伝子破壊は予想よりもかなり困難であった。一方で、共存培養による水素ガス生産は、予備実験ではあるが期待される結果が得られており、次年度以降に進展が期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．遺伝子工学による水素ガス生産の向上について
当初の計画では、ゲノム解析から得られた情報から解凍系からの代謝系遺伝子を選抜し、発現解析から水素ガス生産に重要な役割を果たしていると予測される遺伝子を高発現させたり、抑制すべき遺伝子を破壊する方法を組み合わせて、１モルのグルコースから生産される水素ガスを現在の1.3モルから理論値である2-4モルに近づけることを計画していた。平成26年度にRNA-seq解析を行ってこれら代謝系遺伝子群の発現強度を調べた。今後は、乳酸生成に関与する遺伝子の発現抑制と酢酸・酪酸生成に関与する遺伝子の高発現化によって水素ガス生産の増加を目指す。当初の計画では、遺伝子破壊による乳酸生成遺伝子の発現抑制を計画していたが、これまでの予備的研究から、Clostridium属では遺伝子破壊が非常に困難であることがわかった。そこで、発現抑制には限定的効果しか得られないと予測されるが、遺伝子発現抑制による代謝の影響を調べる目的でアンチセンス方も検討を行う。すでに高発現ベクターは構築できたので、このベクターを応用してアンチセンスRNAを合成させる。
２．セルロースを炭素源とした水素ガス生産系の構築について
植物バイオマスを分解できないC. paraputrificumと植物細胞壁を分解可能なC. josuiが同じ中温菌であることから、これらを共存培養することで植物バイオマスを分解して水素ガスを生産する計画を立てた。現在、培養瓶による予備的な研究結果であるが、これらを2:1でセルロースを炭素源に培養したときに効率よく水素ガスを生産することを見いだしている。今後、両方の菌体の増殖や代謝産物の解析を行って、どのような増殖と代謝が行われているか詳細に解析を行う。この結果は、実用的な観点からも非常に期待できるので、稲わらなどを用いて共存培養による水素ガス生産が可能か検討する。
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| Causes of Carryover |
３月の中旬に遺伝子の発現解析用キットを１セット購入予定であったが、培養装置のトラブルで実験に遅れが生じ、次年度に解析実験を繰り越すことになったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
培養装置が復旧したので、３月に計画していた培養は４月以降に行う。サンプルが調整でき次第、３月の予定であった発現解析の実験を行う予定である。また、平成２７年度の計画でも引き続き詳細な遺伝子解析が必要であることから、これらも残予算を含めて同時に行う。
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Research Products
(4 results)
