2015 Fiscal Year Research-status Report

β-1,3-グルカンによるポリフェノール水溶液の安定化技術の開発

Research Project

Project/Area Number	26350100
Research Institution	Osaka City University
Principal Investigator	鈴木利雄大阪市立大学, 大学院工学研究科, 客員教授 (80511310)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	尾崎嘉彦近畿大学, 生物理工学部, 教授 (00455312) 岸田邦博近畿大学, 生物理工学部, 講師 (30412703)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	βグルカン / p-クマル酸 / 包接 / 黒酵母 / ポリフェノール
Outline of Annual Research Achievements	H26年度に開発した高濃度βグルカン生産法を基にジャーファーメンターを用いた大量培養を検討した。その結果、培養時間は5～7日を要し、βグルカン濃度1.5％(w/w)、粘度10,000cPに達した。次いで、βグルカンの回収法を加熱処理、溶媒沈殿、樹脂回収について検討した結果、除菌後の上清を60%(v/v)以上のエタノールで処理しβグルカンを沈殿回収する方法が効果的であった。得られたβグルカン純度は、約13倍に精製された（N含量 <0.5％、回収率80％）。次いでH26年度に開発した手法により、既存菌株由来のβグルカンを分散剤として溶解度を超えるp-クマル酸溶液の調製条件を検討した。p-クマル酸のMeOH溶液とβグルカン水溶液を一定温度で混和することにより、高濃度のp-クマル酸溶液を調製することが出来た。p-クマル酸濃度はβグルカン濃度に依存して上昇し、βグルカン濃度を4mg/mlとした場合、溶解度のおよそ1.7倍の溶液を調製できた。また、同条件でフェルラ酸およびカフェ酸を分散させたところ、カフェ酸では溶解度の3倍程度の溶液を調製できた。本法により調製したp-クマル酸溶液を30℃、10日間保管したところ、p-クマル酸濃度の大きな低下は見られなかった。動物モデルによる吸収性を指標としたアッセイにより、βグルカンで溶解させたp-クマル酸とプロピレングリコールに溶解させたp-クマル酸について比較した。24時間までのp-クマル酸の尿中排泄率は、前者で42.8±2.1%、後者で37.3 ± 2.1%であり、有意な差は認められなかった（投与溶液のp-クマル酸濃度：5mg/ml、投与量：30mg/kg BW、各群4匹）。また、投与後7時間までの排泄量および投与後7～24時間までの排泄量も、いずれの群も同様のパターンを示し、βグルカンによる消化管内での吸収遅延などの影響は認められなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason １）大量培養条件の確立は出来たが、変異株を用いた可溶化包接解析が遅れている。２）高濃度のp-クマル酸/βグルカンの可溶化複合体の安定性評価が不十分である。
Strategy for Future Research Activity	一般に、βグルカンは3重螺旋構造をした超分子構造をとり、アルカリ性で変性させた後に中性に戻すことで螺旋構造が再構成することが知られている。その手法を使って再構築βグルカン（renatureタイプ）と未処理βグルカン（nativeタイプ）の分子構造が異なる両βグルカンを調製し、包接分散剤として使用して、p-クマル酸の可溶化検討を進める一方、分散包接剤としてのβグルカン素材の大量サンプルの調製も試みる予定である。さらに得られた可溶化p-クマル酸の安定性を評価する。さらに得られた可溶化条件を他の有用な果樹由来難溶性化合物へ応用検討する。最終的に、βグルカンで可溶化させたp-クマル酸を用いて、動物モデルによる吸収性を比較検討する。
Causes of Carryover	分子構造を変えたβグルカンのパイロットレベルの調製を行っていない。可溶化p-クマル酸の大量調製とその安定性解析の詳細評価を行っていない。
Expenditure Plan for Carryover Budget	１）得られた変異株から有用な変異新菌株を選択し、その培養条件の検討を行ない、得られたβグルカンを用いて、分子構造を変えたβグルカン素材の調製に使用する。２）p-クマル酸の可溶化条件の検討に伴う材料代と分析費用、および動物実験に伴う解析費用。