2015 Fiscal Year Research-status Report

抗癌剤耐性獲得における熱ショック蛋白質HSPB1の構造機能相関の解明とその応用

Research Project

Project/Area Number	26350963
Research Institution	Osaka Medical College
Principal Investigator	境晶子大阪医科大学, 医学部, 講師 (30225750)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	田中覚大阪医科大学, 医学部, 講師 (50595741)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	抗癌剤耐性 / HSPB1 / サイトケラチン / オリゴマー構造 / リン酸化
Outline of Annual Research Achievements	抗癌剤を用いる化学療法において，抗癌剤に対する感受性の低下（耐性獲得）が治療上の問題点となる。申請者は，耐性獲得機序の解明を目的としてプロテオーム解析を行い，5-fluorouracil（5-FU）に対する耐性を獲得した細胞株において発現が増加するタンパク質として低分子熱ショックタンパク質HSPB1を同定し，耐性獲得と関連することを示した。本研究では，耐性獲得におけるHSPB1の役割を，そのリン酸化・オリゴマー化・他のタンパク質との相互作用を解析することで明らかにする。 5-FU耐性株においてHSPB1のリン酸化とオリゴマー化の状態をBlue-Native PAGEとWestern blot法で解析した結果，HSPB1のリン酸化される部位の違いがオリゴマー形成に影響することを示し，HSPB1と相互作用するタンパク質としてCytokeratin（CK）8，CK18，CK19を共免疫沈降法と質量分析によって同定した。一方，Paclitaxel（PTX）耐性株のプロテオーム解析の結果，5-FU耐性株とは異なりHSPB1は耐性獲得によりその発現が低下し，また抗癌剤感受性に影響しないことをsiRNA法によって確認している。 HSPB1のリン酸化部位とオリゴマー化を両耐性株で比較したところ，PTX耐性株ではリン酸化部位やオリゴマー化の状態が5-FU耐性株とは異なることが分かった。これはHSPB1の役割を探る上で興味深いことと考える。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 5-FU耐性株で注目したHSPB1は，リン酸化や様々な高分子量のオリゴマーを形成することがその活性発現に関与していると考えられている。5-FU耐性株とPTX耐性株のリン酸化部位を抗リン酸化HSPB1抗体を用いてIPG-Western blot法で比較した。すなわち，IPGストリップを用いて等電点に基づきタンパク質を分離し，それを直接PVDF膜に転写しWestern blot法を行ったところ，両耐性株ではリン酸化部位が異なることが分かった。また，オリゴマーの状態をBlue-Native PAGE法で調べたところ，同様に両耐性株で違いがあった。HSPB1は5-FU耐性株において抗癌剤耐性能に影響するのに対してPTX耐性株耐性株では影響しないことから，この両耐性株における違いを詳細に調べることで，耐性能獲得に関与するリン酸化・オリゴマー化に対する知見が得られると考える。しかし本年度は個人的事情であるが介護や新規講義の準備などにより研究に割く時間が取れず遅れている。
Strategy for Future Research Activity	5-FU耐性株とPTX耐性株におけるHSPB1のオリゴマー化の詳細な検討を行い，その相違点を明らかにする。すなわち，オリゴマー状態を保ったまま分離できるBlue-Native PAGEを一次元目の分離に用い，ゲル中のオリゴマーをSDSで可溶化した後にSDS-PAGEで二次元目の分離を行い，分離したタンパク質を抗リン酸化抗体でWestern blot法にて解析する。これにより，両耐性株のリン酸化とオリゴマー状態の明らかにする。また，相互作用するタンパク質の解析については，同定したCytokeratinが両耐性株においてどの大きさのオリゴマーと相互作用しているか，また，リン酸化以外の翻訳後修飾についても解析を行う予定である。
Causes of Carryover	今年度の計画が遅れているため次年度使用額が生じた。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度の物品費などと合わせて使用する。