2015 Fiscal Year Research-status Report
分離分析を活用する副反応進行下での平衡反応解析法の確立
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26410154
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
高柳 俊夫 徳島大学, ソシオテクノサイエンス研究部, 教授 (50263554)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
薮谷 智規 愛媛大学, 社会連携推進機構紙産業イノベーションセンター, 教授 (80335786) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | キャピラリーゾーン電気泳動 / 速度論反応 / 酸解離定数 / 酵素反応 / ブプロピオン / ヘキサメチレンテトラミン / カルボキシエステラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，水溶液一相系で分離分析を行うキャピラリーゾーン電気泳動法（CZE）を用いて，速度論反応等の副反応の進行下での平衡反応解析法を確立することを研究目的とした．分離分析であるCZEでは，数分～数十分の測定時間と比較して遅い反応速度を有する物質（分解生成物など）は測定対象となる物質から分離されるので，分解生成物の影響を排除して測定対象物質の挙動を測定する点を特徴とした研究である．
本年度は，比較的遅い反応速度を有する反応系を対象とした研究として，加熱条件下で比較的迅速に分解するブプロピオンの酸解離定数の決定を行った．ブプロピオンの酸解離平衡は迅速な反応であり，CZEによる電気泳動移動度の測定では，プロトン付加体とプロトン解離体の加重平均の電気泳動移動度として測定される．分解生成物が存在する系において，ブプロピオンについて分解生成物の影響を受けることなく酸解離定数を決定することができた．また，LC-MSおよびCZEにより分解生成物として3-クロロ安息香酸を同定した．
昨年度からの継続研究として，酸性溶液中で徐々に分解するヘキサメチレントテラミン（ヘキサミン）の酸解離平衡に関する検討を進めた．ヘキサミンはプロトン化し得る4つのアミン部位を有しているが，ヘキサミンをN-エチル化した物質との電気泳動移動度の比較，中和滴定の結果を通して，1つアミンが酸解離平衡に関与する1段階の平衡反応であることを明らかにした．
また，比較的遅い反応である酵素反応について，カルボキシエステラーゼによるp-ニトロフェニルアセテートの加水分解反応を対象として研究を進めた．オフライン（プレキャピラリー）で酵素反応を行いCZEにより反応生成物であるp-ニトロフェノレートを分離検出し，分単位での反応速度を認めた．今後，オンキャピラリーでの反応解析を進める予定である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ブプロピオンは加熱条件下で分解し，その分解反応速度が比較的遅いので分解生成物の影響を受けることなく酸解離定数を決定することも可能であるが，分解生成物が共存する系での酸解離定数の決定例として検討を行った．分解反応下でブプロピオンのCZEシグナルは減少したが，分解生成物の影響を受けることなく目的物質であるブプロピオンの電気泳動移動殿測定を通してその酸解離定数を決定することができた．昨年度実施した酸性領域で分解性を示すプラバスタチンの反応解析を拡張するものである．
酸性で易分解性を有するヘキサメチレンテトラミンは，プロトンが付加し得る第3級アミンを4つ有しているために多段階の酸解離平衡が考えられる．CZEの電気泳動移動度の変化に基づく解析では反応の段階数を決定できなかったので，異なるアプローチから反応の段階数の決定を行った．プロトン化したヘキサミンと1つのアミンをN-メチル化したヘキサミンの電気泳動移動度の比較，中和滴定でのおよその当量点から，1段階のプロトン化であることを確認した．
インキャピラリーでのカルボキシエステラーゼの酵素反応の解析に先立ち，オフラインでの酵素反応を検討した．基質であるp-ニトロフェニルアセテートは中性pH条件下でカルボキシエステラーゼにより徐々に加水分解する．CZEによる経時測定により，反応生成物であるp-ニトロフェノレートが徐々に増加することをCZE分離により確認し，その分解反応速度はCZE分離時間と同等の数十分程度である．インキャピラリーでの酵素反応もすでに取り組んでおり，キャピラリー中での基質の滞在時間に伴う反応生成物の増加を確認した．
また，CZEによる酸解離平衡の解析に関する内容を，Analytical Chemistry誌に論文掲載することができた．
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は本研究課題の最終年度であり，CZEの分離時間と同程度の反応速度を有する酵素反応について，オンキャピラリーでの酵素反応の解析を進める．酵素を含む泳動液中に基質であるp-ニトロフェニルアセテートを試料液として導入し，電気泳動分離すると，p-ニトロフェニルアセテートはキャピラリー中で酵素により徐々に分解され，オンキャピラリーでp-ニトロフェノレートを生成する．生成したp-ニトロフェノレートは陰イオンであり基質のp-ニトロフェニルアセテートから徐々に電気泳動分離される．すなわち，キャピラリー中で反応しながら分離される現象を追う．また，p-ニトロフェノレートは7程度のpKaを有する弱酸であり，泳動液のpHにより有効な電気泳動移動度が変化する．酵素反応による速度論的因子と酸解離反応による平衡論的因子との兼ね合いから観測される電気泳動シグナルが変化すると考えられ，CZE分離による平衡論，速度論の物性分析法の確立を進める．
また，易分解性物質の酸解離平衡の解析に関して，解析対象の拡大を図り，解析結果の蓄積を続ける．易分解性の医薬品としてヒドロクロロチアジドをとりあげて分解反応下での酸解離平衡を解析し，本解析法が有効な対象を拡張する．
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| Causes of Carryover |
本年度分に必要な薬品，器具を十分調達できた．電気泳動装置が老朽化しており，修理の必要が生じることもあるため，次年度に繰り越した．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度への繰越金は，電気泳動消耗品であるランプ，薬品の購入に用いる予定である．
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[Journal Article] Analysis of Chemical Equilibrium of Silicon-Substituted Fluorescein and Its Application to Develop a Scaffold for Red Fluorescent Probes2015
Author(s)
K. Hirabayashi, K. Hanaoka, T. Takayanagi, Y. Toki, T. Egawa, M. Kamiya, T. Komatsu, T. Ueno, T. Terai, K. Yoshida, M. Uchiyama, T. Nagano, and Y. Urano
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Journal Title
Analytical Chemistry
Volume: 87(17)
Pages: 9061-9069
DOI
Peer Reviewed
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