2014 Fiscal Year Research-status Report
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26430010
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
杉山 清佳 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (10360570)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 臨界期 / 弱視 / ホメオ蛋白質 / 抑制性介在ニューロン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
子どもの脳には、経験に応じて神経回路を柔軟に形成する「臨界期」がある。これまでに申請者は、ホメオ蛋白質Otx2が経験によって大脳視覚野の抑制性介在ニューロンに運ばれ、視覚の臨界期を制御することを明らかにした。本研究では、Otx2の標的遺伝子として23種類のホメオ蛋白質に注目し、臨界期への関与を明らかにする。ホメオ蛋白質は、生後の脳においても発現することが知られているが、未だ生後脳における役割が明らかになった遺伝子は数少ない。
そこで２６年度には、ChIP-seq解析より得られたOtx2標的遺伝子の中から、Otx2変異マウスなどを用いて発現解析（RNA-seq等）を行い、臨界期に関与する候補ホメオ蛋白質のスクリーニングを行った。その結果、Otx2がクロマチン制御領域に直接結合する標的ホメオ蛋白質であっても、Otx2が局在する臨界期の皮質抑制性介在ニューロンにおいて、有効な発現が検出されるホメオ蛋白質は少なかった。このことから、標的ホメオ蛋白質の多くは、胎児期の神経上皮細胞（幹細胞）においてOtx2による制御を必要とし、生後の抑制性介在ニューロンでは発現を抑制されている可能性が考えられた。さらに、抑制性介在ニューロンにおいて発現が認められる標的ホメオ蛋白質であっても、Otx2の欠如によって発現が変化しないものもあった。結果として、本年度の解析から①Otx2標的ホメオ蛋白質であり（Otx2が直接クロマチン制御領域に結合し）、②Otx2変異マウスの抑制性介在ニューロンにおいて発現が変化するホメオ蛋白質は、４種類ほどであった。そのうち１つは、既に変異マウスを入手済みであり、今後、臨界期への関与を解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
２６年度は、ChIP-seq解析より得られたOtx2標的遺伝子の中から、Otx2変異マウスなどを用いて発現解析（RNA-seq等）を行い、臨界期に関与する候補ホメオ蛋白質のスクリーニングを行った。特に、臨界期にOtx2が局在する抑制性介在ニューロンをFACS（fluorescence activated cell sorting）により分取し、発現解析を行うことで、当初２３種類あった標的ホメオ蛋白質の中から、４種類まで候補ホメオ蛋白質を絞り込んだ。生後の脳組織から細胞種を分取する方法は新しく、今後、脳組織内の神経細胞から分子生物学研究を行う際には、欠かせない技術になると考えられる。
内在性Otx2の標的遺伝子、特に、脳の神経細胞におけるOtx2のクロマチン結合領域についてはこれまで良く分っていなかった。今回の研究により、Otx2の標的ホメオ蛋白質だけでなく、全クロマチン領域にわたるOtx2の標的遺伝子の全貌が明らかになってきた。その結果、ホメオ蛋白質以外にも、臨界期に関与すると思われる標的遺伝子の存在が明らかになった。また、Otx2の標的ホメオ蛋白質においても、胎児期の制御メカニズムを反映すると思われるクロマチン結合が多く見られており、生後のみならず、胎児期におけるOtx2標的遺伝子を推測することが可能である。抑制性介在ニューロンから発現解析を行うことにより得られた本結果は、当初想定していた成果以上であった。実際に、臨界期の抑制性介在ニューロンにおいてOtx2により発現を制御される標的遺伝子については、今後、臨界期における作用機構を明らかにする。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の解析によって同定された４種類のOtx2標的ホメオ蛋白質のうち、１つについては変異マウスを入手済みである。このホメオ蛋白質は、特に、視覚の臨界期に重要な視覚野第II/III層に強く発現しており、錐体細胞、抑制性介在ニューロン（PV細胞）、アストロサイトに発現が認められる。現在、このホメオ蛋白質のfloxマウスを錐体細胞特異的なCamKII-CreあるいはPV細胞特異的なPV-Creと掛け合わせている。これまでに、視覚誘発電位記録法（VEP）を用いて、変異マウスの視力を予備的に記録した結果、このマウスは正常な視力発達を提示する一方、臨界期の頃に片目を閉じても弱視にならず、臨界期の誘導が起きないことが示唆された。今後、細胞特異的なKOマウスを使用して臨界期の始まりと終わりの時期を解析し、錐体細胞あるいはPV細胞における機能を明らかにする。さらに、ゴルジ染色により細胞形態を解析し、興奮性・抑制性のシナプスマーカー因子の局在を観察することで、錐体細胞とPV細胞が正常に発達しているのか明らかにする。このホメオ蛋白質はOtx2と同様に、細胞間を移動するための配列を持つことが示唆されている。したがって、Otx2と同様に蛋白質を視覚野に直接投与することで、皮質細胞内に取り込まれることが推測される。研究室において作成済みのホメオ蛋白質を浸透圧ポンプにより皮質投与し、取り込まれやすい細胞を同定し、細胞の発達と臨界期に与える影響を解析する。
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| Causes of Carryover |
支出予定内訳のうち、次世代シークエンス解析機器の混雑による利用時期の延期と利用費の繰越（試薬キット等の消耗品費６０万円）、研究補助員の産休による雇用体制の見直し（６０万円）、および国内旅費の支出先の見直し（１５万円、５万円は３月支出済）によって、未執行額が発生した。これらの未執行額は２７年度以降、本研究を推進するために有効に使用する予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
未執行額については、以下のとおり今年度に使用する予定である。
＜具体的な使用計画＞次世代シークエンス解析費（試薬キット等の消耗品費）として６０万円 （２６年度中に依頼し、現在は機器使用の順番を待っている状態）、研究補助員の雇用費として６０万円、論文作成費（英文添削費等）として１５万円。
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