2016 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of molecular mechanisms related to functions of the neuromuscular junction using an in vivo synapse model
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26440080
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
宮澤 淳夫 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (60247252)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福永 優子 千葉科学大学, 危機管理学部, 准教授 (80254522)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アセチルコリン受容体クラスター / 神経筋接合部 / 電子顕微鏡 / 相関顕微鏡法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、ニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）クラスター構造の成熟時には、シナプス外の細胞膜に存在しているnAChRがエンドサイトーシスされ、細胞内を経由してポストシナプス膜へ移動する可能性について示唆されている。また、nAChRクラスター構造の成熟に必須なポストシナプスタンパク質である筋特異的受容体チロシンキナーゼ（MuSK）のエンドサイトーシスが、運動神経からの分泌タンパク質であり、クラスター構造成熟の引き金となるagrinによって促進されるという報告があることから、agrin依存的なnAChRとMuSKの局在変化について、細胞膜表面だけでなく細胞内についても検証を行った。
方法としては、初期発生型の未成熟nAChRクラスターを生じているC2C12細胞由来培養筋管細胞膜上のnAChRとMuSKに直径の異なる金ナノ粒子と蛍光標識を施し、agrin存在下で筋管細胞の培養を続けることによってクラスター構造の成熟を促進させ、nAChRとMuSKの局在を共焦点レーザースキャン顕微鏡（LSM）と走査型電子顕微鏡（SEM）を用いた相関顕微鏡法で調べた。金ナノ粒子で標識した細胞内タンパク質の分子局在を電子顕微鏡で観察する場合には、超薄切片を作製して透過型電子顕微鏡で観察方法が一般的である。しかしながら、LSMで蛍光観察したnAChRクラスター部位を電子顕微鏡で探し、広範囲に渡ってnAChRまたはMuSKがエンドサイトーシスされた小胞を探すためには、超薄切片は向いていない。そこで超薄切片より厚くて大きな準超薄切片を作製し、反射電子検出器を利用してSEMで広範囲に渡ってnAChRとMuSKの細胞内局在を調べた。
また、ES細胞から分化させた運動神経とC2C12細胞由来筋管細胞による共培養系でも、シナプスでnAChRクラスターの形成を確認することができた。
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