ペルオキシソームタンパク質輸送における分子ネットワークの解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26440157
• Research Institution: National Institute for Basic Biology
• Principal Investigator: 真野 昌二 基礎生物学研究所, 多様性生物学研究室, 助教 (20321606)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ペルオキシソーム / タンパク質輸送 / シロイヌナズナ / apem変異体 / タンパク質間相互作用 / Peroxin / GFP / ゼニゴケ

Outline of Annual Research Achievements

ペルオキシソームは、植物のみならず胴部や酵母など真核細胞に存在するオルガネラで、植物では、脂肪酸代謝や光呼吸、活性酸素種の除去など様々な機能を担っている。これらのペルオキシソームの機能が低下すると、種子の発芽不全や個体の成長抑制、配偶子認識異常、種子の稔性低下など植物の生育異常を引き起こす。ヒトにおいてもペルオキシソーム機能の欠損は重篤な遺伝子疾患につながり、酵母では特定の炭素源培地でしか生育できなくなることから、個体の維持にはペルオキシソームの機能が必須であることが明らかになりつつある。ペルオキシソームは独自のゲノムをもたないため、構成するタンパク質は全て核遺伝子にコードされている。そのため、ペルオキシソームの様々な機能の発現には、遺伝子発現後の正確なペルオキシソームへのタンパク質輸送が重要である。しかしながら、その分子機構は十分に理解されていない。本研究では、ペルオキシソームへのタンパク質輸送に関わる因子群の分子ネットワークを明らかにし、植物機能を支えるペルオキシソーム機能発現を分子レベルで理解することを目指す。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

apem変異体における植物個体への影響、特に配偶子認識に関わるペルオキシソーム変異による影響を明らかにすることができた。apem2/PEX13 などのペルオキシソームタンパク質輸送に異常をきたすシロイヌナズナ変異体では、過酸化水素濃度が異常になっていることをイメージング解析により明らかにした。
ゼニゴケを用いた解析では、Citrine-PTS1 および RFP-PTS2 を発現させてペルオキシソームを可視化させることに成功した。このことは、陸上基部植物であるゼニゴケにおいても、PTS1、PTS2のタンパク質輸送経路が保存されていることを示している。ゼニゴケの実験を遂行するにあたり、プロモーター置換が可能な30種類以上のゼニゴケ用 Gateway ベクターを構築した。

Strategy for Future Research Activity

シロイヌナズナにおけるペルオキシソーム因子の BiFC によるタンパク質間相互作用の実験結果をまとめるとともに、ゼニゴケの因子においても相互作用解析を進める。ゼニゴケにおけるタンパク質輸送の分子機構を明らかにするため、既にペルオキシソームが可視化された形質転換体を親株として、シロイヌナズナ因子のホモログと推定される因子をコードする遺伝子を CRISPR/Cas9 の系で破壊して、その影響を明らかにする。既に、CRISPR/Cas9 のコンストラクションは終了して、現在、形質転換を進めている。

Causes of Carryover

平成27年度の5月に研究室の引っ越しがあり、新たな研究室のセットアップ等に時間がかかってしまったため、実験に用いる消耗品などの使用量も減少した。セットアップ後、研究は順調に進み始めたので、本来、平成27年度に使用予定であった経費の一部を次年度に使用することで、本申請課題をさらに発展させていく。

Expenditure Plan for Carryover Budget

これまでに解析してきたシロイヌナズナのペルオキシソーム因子の相互作用解析と、新たに同定したゼニゴケにおけるペルオキシソーム因子の相互作用、および CRISPR/Cas9 により遺伝子破壊された変異体の表現型を明らかにする。 CRISPR/Cas9 のコンストラクト作製は本年度において完了しており、平成28年度に直ぐに形質転換できる状況にある。翌年度分として請求した助成金と合わせた研究費は、植物の生育と分子生物学実験を行う技術支援員の雇用費、実験用の消耗品、実験結果を論文としてまとめるための英文校閲費や投稿料、学会発表を行う際の旅費に充当する。

Research Products

• [Journal Article] Quantifying morphological features of actin cytoskeletal filaments in plant cells based on mathematical morphology. (2016)
  • Author(s): Kimori, Y., Hikino, K., Nishimura, M., and Mano, S.
  • Journal Title: J. Theor. Biol. Volume: 389 Pages: 123-131
  • DOI: 10.1016/j.jtbi.2015.10.031
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Phosphorylation of the C-terminus of RHD3 has a critical role in homotypic ER membrane fusion in Arabidopsis. (2016)
  • Author(s): Ueda, H., Yokota, E., Kuwata, K., Kutsuna, N., Mano, S., Shimada, T., Tamura, K., Stefano, G., Fukao, Y., Brandizzi, F., Shimmen, T., Nishimura, M., and Hara-Nishimura, I.
  • Journal Title: Plant Physiology Volume: 170 Pages: 867-880
  • DOI: 10.1104/pp.15.01172
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. (2016)
  • Author(s): Kanai, M., Mano, S., Kondo, M., Hayashi, M., and Nishimura, M.
  • Journal Title: Plant Biotechnology Journal Volume: 14 Pages: 1241-1250
  • DOI: 10.1111/pbi.12489
  • Open Access
• [Journal Article] Dynamics of the light-dependent transition of plant peroxisomes. (2015)
  • Author(s): Goto-Yamada, S., Mano, S., Yamada, K., Oikawa, K., Hosokawa, Y., Hara-Nishimura, I., and Nishimura, M.
  • Journal Title: Plant and Cell Physiology Volume: 56 Pages: 1252-1263
  • DOI: 10.1093/pcp/pcv081
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Physical interaction between peroxisomes and chloroplasts elucidated by in situ laser analysis. (2015)
  • Author(s): Oikawa, K., Matsunaga, S., Mano, S., Kondo, M., Yamada, K., Hayashi, M., Kagawa, T., Kadota, A., Sakamoto, W., Higashi, S., Watanabe, M., Mitsui, T., Shigemasa, A., Iino, T., Hosokawa, Y., and Nishimura, M.
  • Journal Title: Nature Plants Volume: 1 Pages: 15035
  • DOI: 10.1038/NPLANTS.2015.35
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Dynamics of peroxisomes and oil bodies based on imaging approach: Molecular players, mechanisms, and roles in metabolisms (2016)
  • Author(s): Mano, S., Oikawa, K., Goto-Yamada, S., Shibata, M., Cui, S., Hayashi, M., and Nishimura, M.
  • Organizer: 第57回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 岩手大学（岩手県・盛岡市）
  • Year and Date: 2016-03-18 – 2016-03-20
  • Invited
• [Presentation] Chaperone and protease functions of LON protease 2 modulate the peroxisomal transition and degradation with autophagy (2016)
  • Author(s): Goto-Yamada, S., Mano, S., Nakamori, C., Kondo, M., Yamawaki, R, Kato, A., and Nishimura, M.
  • Organizer: 第57回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 岩手大学（岩手県・盛岡市）
  • Year and Date: 2016-03-18 – 2016-03-18
  • Invited
• [Presentation] 受精を支える植物ペルオキシソームの形成と機能の意義 (2015)
  • Author(s): 真野昌二、山口千波、曳野和美、加藤恭子、西村幹夫
  • Organizer: BMB2015
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県・神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
  • Invited
• [Presentation] 形態変化を伴ったオルガネラ間相互作用の解析～オルガネラ間接着力測定の試み～ (2015)
  • Author(s): 及川和聡、真野昌二、近藤真紀、坂本亘、三ツ井敏明、飯野敬矩、細川陽一郎、西村幹夫
  • Organizer: 日本植物学会第79回大会シンポジウム
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ（新潟県・新潟市）
  • Year and Date: 2015-09-06 – 2015-09-08
  • Invited
• [Remarks] 研究業績
  • URL: http://www.nibb.ac.jp/plantorganelles/paper.html