2014 Fiscal Year Research-status Report
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26460122
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
松浪 勝義 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 教授 (70379890)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大塚 英昭 安田女子大学, 薬学部, 教授 (00107385)
杉本 幸子 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 講師 (60549012)
山野 喜 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 助教 (70650597)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | マダガスカル / 未開拓植物 / 活性成分探索 / 化学構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H26年度はマダガスカル産植物サンプルの入手とMeOHによる抽出、得られたMeOH抽出物のシリカゲルカラムによるフラクションライブラリーの作成、A549ヒト癌細胞に対するがん細胞増殖抑制効果、顧みられない熱帯病（NTD: Neglected Tropical Diseases）」の一つで1200万人の感染者がいるとされるリーシュマニア症の原因原虫の一種であるLeishmania majorに対する増殖抑制活性試験、種々の生活習慣病の原因になるとされるラジカル除去活性試験などを行い有用性を評価した。
研究対象とする植物サンプルについては、マダガスカルの国立研究所Center for Applied Pharmaceutical Research (CNARP) との共同研究により、MTA (Material transfer agreement)の締結の後、AIZOACEAE（ハマミズナ科）、APOCYNACEAE（キョウチクトウ科）、BIXACEAE（ベニノキ科）、CONVOLVULACEAE（ヒルガオ科）、CELASTRACEAE（ニシキギ科）植物など計30種から葉、根、枝など部位の異なる約70種のサンプルを得た。また、上記とは別にOhio State University, Medicinal Chemistry and Pharmacognosyとの共同研究でマダガスカル産植物サンプル53種を入手した。これら123種のマダガスカル植物サンプルをベースにフラクションライブラリーの調整などを検討し、上記の活性試験を行ったところ、Budleia（フジウツギ属）、Helichrysum（ムギワラギク属）などの36種の植物に活性を見出した。現在、活性成分について検討をすすめているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の進行にあたって最も重要なのは日本から遠く離れたマダガスカル産植物サンプルの入手である。現地の共同研究者と綿密に計画を立てることで100種を超えるマダガスカル産植物サンプルを入手できたことで研究進行に最も大きな壁になる段階をクリアすることができた。また、フラクションの作成ではいたずらに分画数を多くすることは後の活性評価に影響が大きいため、先ず、少数のモデルサンプルで分画規模の検討をおこなった。その結果、まず、予備検討として15種の植物についてシリカゲル担体によるフラクションライブラリーの調製とTLCによる分析、活性評価の検討をおこなった。その結果、クロロフィルや脂肪酸類を多く含む疎水性に富んだフラクションと最も極性の高いMeOH溶出部は活性や含有成分の複雑さなどにより除去したほうが効率的であり、中間の溶出条件では、程度の差こそあれ、比較的活性成分が広範囲にわたって分布している傾向が見られたことから、以後のフラクションライブラリーの調製についてはCHCl3, CHCl3：MeOH=5:1, CHCl3：MeOH=2:1, MeOHで分画することにした。4分画程度に分画することで十分であることが分かり、スクリーニング規模を無駄に大きくせず活性評価を行うことができた。その結果、複数の候補植物サンプルを選定できたことから、本年度の研究は十分に目的を達成できたと考えている。サンプルの追加入手や活性成分の分画精製も順調に進行していることから本年度の達成度はおおむね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
①活性の見られた植物の大量入手に関しては36種のうち一部にとどまっていることから（36種すべての大量採取をするには予算不足、また、ひとつの植物についての成分研究でさえ時間も人手も必要であるため）今年度も継続して植物サンプルの入手を行う。
②既に大量入手した植物サンプルについて引き続き分画、精製を行う。活性化合物が単離されればNMR, MS, IR, UV, MSなどの種々のスペクトルデータの測定と解析を行い、相対配置までの化学構造の解明を達成する。次に絶対配置の決定にあたってはCDスペクトルの解析や、場合によっては改良Mosher法などの化学的手法により絶対配置の検討をおこない、最終的に絶対配置を含めた化学構造の決定を達成する。
③得られた活性化合物についてそのメカニズム解析の手掛かりを得るため、mRNAの発現変動について解析を始める。
＜次年度の研究費の使用計画＞①については採集費用、例えば、分類学の専門家の依頼、採集における人件費、輸送コスト、抽出に必要な試薬代などが必要。②分画精製に必要なカラムクロマトグラフィー担体、TLCプレート、各種有機溶媒、NMR測定用サンプルチューブや重水素化溶媒、共通機器であるNMR使用料などが必要。また、活性を指標に分画を進めるので細胞培養に必要な培養ディッシュ、96well プレート、培地、動物血清、抗生物質、発色試薬などが必要③mRNAの抽出に必要なTrizolなどのRNA精製試薬、cDNA合成に必要な逆転写酵素やプライマー、発現変動にはcDNA subtraction kit (Clontech）など高価な試薬類が必要である。また、得られたcDNAのクローニングに必要なコンピーテントセル、制限酵素、DNA精製キット、電気泳動試薬、シーケンス反応試薬（Big dye terminator) が必要。
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