肺癌におけるR-spondin-Lgr6シグナル系の発現・機能解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460436
• Research Institution: Fukuoka Dental College
• Principal Investigator: 橋本 修一 福岡歯科大学, 歯学部, 教授 (00243931)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 肺癌 / 幹細胞 / Lgr6 / R-spondin / Wnt / beta-catenin

Outline of Annual Research Achievements

[目的] R-spondin/Lgr6（ヒト肺幹細胞マーカー）受容体シグナルはWnt/β-cateninシグナルを増強する。本研究では肺癌（幹）細胞における同シグナル系の遺伝子変異解析と機能解析を目的とする。
[材料と方法] 初年度は、まず、Lgr6の構成exonに対するPCR用プライマーを作成し、ヒト肺腺癌細胞株（A549、PC9）およびヒト非肺癌細胞株（VA10、BEAS2B）に対し、Lgr6の変異解析をdirect sequence 法にて行った。次に、Lgr6プロモーター領域の非メチル化、メチル化特異的PCR用のプライマーを設計し、それらのPCR解析を行った。2年目から実際のヒト肺癌症例からのDNAサンプルの収集を開始し、これらを対象に細胞株と同様にLgr6の変異解析を施行中である。また、Lgr6の野生型遺伝子をpIRESpuro3 (Clontech) に組込み、野生型Lgr6の発現プラスミド作成を試みているところである。
[結果] Lgr6遺伝子exon1～20のすべての領域のdirect sequence 解析から、exon3、exon16に1ヵ所、exon20に3ヵ所の一塩基置換変異を認めた。このうち、exon16の1ヵ所、exon20の2ヵ所はsilent mutationであったが、exon3、exon20の1ヵ所はこれまでに報告のない新たな有意な1塩基置換変異であった。また、メチル化特異的PCR解析から、A549はメチル化のパターンが有意である結果を得た。
以上の結果より、肺癌細胞においては、Lgr6遺伝子が変異によりあるいはそのプロモーター領域のメチル化のパターンにより発現の特異性が制御されている可能性が示唆されている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

H27年1月1日付で熊本大学医学部機能病理学（准教授職）から福岡歯科大学病態構造学（教授職）へ異動となったため、新しい環境下での研究体制の立ち上げに時間を要したため。

Strategy for Future Research Activity

ヒト肺癌症例癌細胞および非癌部細胞からのDNAサンプル数を増やし、これまでに行ったヒト肺癌細胞株を対象とした基礎実験より得られた条件をもとに、Lgr6の全exon PCR解析に基づくdirect sequence解析、およびメチル化特異的PCRによるLgr6プロモーター領域のメチル化解析を行い、ヒト肺癌症例を対象とした臨床研究を進めていく。また、現在、Lgr6の野生型遺伝子をpIRESpuro3 (Clontech) に組込み、野生型Lgr6の発現プラスミド作成を試みているところであり、これをもとに野生型Lgr6から変異型Lgr6遺伝子をQuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene) を用いて作成する。これら、野生型、および、変異型Lgr6遺伝子プラスミドをVA10およびBEAS2B、ならびに肺癌細胞株に導入し、それぞれの細胞動態、発現遺伝子動態、発現蛋白動態を解析し、Lgr6の肺癌細胞における機能を明らかにすることを目標とする。最後にまとめと総括を行う。