2016 Fiscal Year Annual Research Report
The function of disulfide bond in tight junction protein, as an oxidative sensor
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26460455
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
田中 敏 北海道大学, 医学研究科, 特任准教授 (30374250)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | タイト結合 / redox / ジスルフィド結合 / ユビキチン / thioredoxin |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タイト結合蛋白occludinのジスルフィド結合を介したoccludin安定性に関る分子機構や、その細胞機能への影響を探るためために以下の実験を行い、結果を得た。
1、H2O2曝露状態で野生型およびシステイン変異型occludinの量を測定したが、いずれにも通常状態と比べて大きな変化は見られなかった。
2、ユビキチンE3リガーゼITCH結合部位（PPxY）変異型occludinは低酸素環境での安定性が増す。低酸素でのPPxY変異型occludinの細胞内と細胞膜上の量の変化をウェスタン解析で測定、比較したところ、細胞質内の量はほとんど変化しないものの、細胞膜上では変異型occludinがむしろ増加していた。ただし、低酸素で細胞膜上のoccludinが細胞質内へ移動が阻害されるか否かの確認はできなかった。
3、共免疫沈降でPPxY変異型occludinとITCHの結合性消失が確認できた。また、ITCHとの共免疫沈降で、システイン変異型occludinは野生型に比べてITCHとより多く結合する傾向が見られた。occludinの共免疫沈降で、細胞膜上だけでなく細胞質内でもoccludinとoccludinの相互作用があることが確認できた。
4、PPxY変異型occludinを導入した細胞は、細胞増殖性が減少する傾向を示した。Occludinが高発現している細胞株で見られたことから、PPxY変異型occludinが細胞増殖に関してdominant negativeに働くことが示唆された。免疫染色ではMIB-1の染色性には違いがないものの、cleaved caspase-3が有意に多く染色され、アポトーシスが亢進することが示された。
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