トランスシアリダーゼを標的としたシャーガス病治療薬の探索

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460508
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 上村 春樹 長崎大学, 熱帯医学研究所, 講師 (60184975)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: トランスシアリダーゼ / シャーガス病 / トリパノソーマ

Outline of Annual Research Achievements

トランスシアリダーゼは、寄生性のトリパノソーマ属原虫の一部のみに検出される特徴ある酵素で、ヒト等の宿主哺乳動物や媒介昆虫には存在しない。シャーガス病の病原原虫Trypanosoma cruziにおいては、哺乳動物に感染した血流中でのトリポマスチゴ－トで非常に高い活性が検出され、宿主由来の糖複合体の末端にあるシアル酸を切断して、原虫表面のガラクトース受容体に転移する活性を示す。トランスシアリダーゼ及びシアル酸を受取った分子は、原虫の宿主防御機構からの認識回避、免疫抑制、宿主細胞との接着、侵入等、原虫のヒトへの感染に重要であることが示されており、シャーガス病治療薬開発のターゲットとして注目されている。しかしトランスシアリダーゼに対する有効な阻害剤が見つかっておらず、その機能も十分な検証に至っていないのが現状である。
本研究の目的は、東京大学創薬オープンイノベーションセンターの協力を得て行っているトランスシアリダーゼ阻害剤のスクリーニングを発展させて、治療薬開発のリード化合物を得ること、それらを用いてトランスシアリダーゼの機能と阻害の検証研究を行うことである。
平成26年度には、クローニングしたT. cruziトランスシアリダーゼを大腸菌で発現、精製して酵素活性阻害を指標として化合物ライブラリーのスクリーニングを行った。蛍光ラベルシアル酸誘導体4MU-NANAを用いてシアリダーゼ活性の阻害を調べることで、9,600化合物コアライブラリーをスクリーニングして、0.01mMで50%阻害活性を示す化合物を12化合物得て、さらにそれらの類似化合物を含む70の化合物を調べて8化合物に安定して阻害活性が認められることを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

この研究における最初の問題は、トランスシアリダーゼ活性を阻害するリード化合物となるものが見つかるか、ということである。9,600化合物コアライブラリーのスクリーニングから、0.01mMで50%阻害活性を示す化合物を12、さらにそれらの類似化合物のスクリーニングから8化合物に阻害活性を認めたことは、この8化合物がリード化合物として期待が持てること、トランスシアリダーゼの機能を調べる次の段階の実験でこれまでよりはっきりした結果が期待できることを示唆している。

Strategy for Future Research Activity

リード化合物の候補となる8化合物を基に次の実験を行う。
1．これら8化合物の阻害機構と阻害係数を求める。これら8化合物の阻害活性にLactoseの存在で影響を受けるものと受けないもの、活性測定中の反応液のｐHで大きく影響を受けるものを受けないものがあり、それぞれの化合物がトランスシアリダーゼを阻害する機構と阻害の強さを調べる。
2．原虫の宿主細胞への接着、侵入とparasitophorous vacuoleからのescapeに対しての阻害を調べる。トランスシアリダーゼは、原虫の宿主細胞との接着、侵入、parasitophorous vacuoleからのescape、感染成立のいくつか段階に重要な役割をしていることが示唆されている。阻害活性の認められた化合物を用いて原虫の宿主細胞への感染過程への影響、感染防御の効果を調べる。
3．トランスシアリダーゼファミリータンパク質の構造と機能の解析を行う。トランスシアリダーゼは数多くの遺伝子ファミリーから成り、Tyr342のHisへの置換によって酵素活性を失っているものをはじめ、ところどころにアミノ酸置換が見られる多数のファミリーから成り立っていてそのすべてが発現している。これら種々のvariantsの阻害剤との相互作用、宿主細胞との相互作用における役割を調べる。

Causes of Carryover

平成26年度の使用額が予定より少なかったのは、9,600化合物コアライブラリー、さらにそのスクリーニングに続く類似化合物を用いたスクリーニングによって絞られてくるリード化合物を購入する予定であったが、その時がずれたことが主たる理由である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成27年度には、スクリーニングによって得られたリード化合物の候補、8化合物を購入し、それを用いてトランスシアリダーゼと基質、阻害剤の生化学的実験、トリパノソーマ原虫の宿主細胞との相互認識、細胞侵入等の実験に用いる。これらに必要となる物品費に主として使用する計画である。
また、多くの原虫株に対しての効果を調べる必要が出てくることが予想され、従来から共同研究を行っているDｒ. Sergio Schenkman, Universidade Federal de São Paulo（サンパウロ、ブラジル）の研究室を訪問して実験を行うことを考えている。それにかかわる旅費も予定している。