Rho関連キナーゼが心不全病態を修飾する新規分子機構の解明と治療薬開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461127
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 竹藤 幹人 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (20709117)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 天野 睦紀 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90304170)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 心不全 / リン酸化 / 低分子量RhoA

Outline of Annual Research Achievements

低分子量RhoAは細胞骨格形成、細胞遊走など様々な細胞内機能を制御しており、その機能は高血圧、癌などの疾患発症に関与していることが知られている。低分子量RhoAが制御する細胞内シグナルが疾患については長年、研究されてきたが、低分子量RhoAおよびその下流で機能する分子の心臓での働きは不明な点が多い。
本研究では低分子量RhoAの標的分子であるRho関連キナーゼに注目し、Rho関連キナーゼの心臓内での新規標的分子を明らかにする。Rho関連キナーゼを検討することにより、心不全発症のメカニズムについて明らかにすることを目的とする。キナーゼは新規治療薬開発の点からも注目されており、本研究は創薬にむけた基盤研究になりうる。
平成26年度は、心筋細胞に発現するRho関連キナーゼをPCR法により解析を行い、心筋細胞に発現するRho関連キナーゼを同定した。心筋細胞に発現するRho関連キナーゼの基質を生化学的手法により網羅的に解析を行った結果、心不全発症に関与する遺伝子発現を制御する転写因子がRho関連キナーゼによりリン酸化されることを見出している。転写因子のセリン・スレオニンをアラニン置換し、リン酸化の変化を生化学的手法により評価し、リン酸化サイトを同定している。同部位のリン酸化抗体も作成中である。Tamoxifen誘導性心筋特異的Rho関連キナーゼの遺伝子欠損マウスを作製しており、アンギオテンシンＩＩの慢性投与による心不全がRho関連キナーゼ欠損により改善している傾向を見出している。今後、圧負荷心不全モデルなどを用いて、Rho関連キナーゼの心不全における役割を検討する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成26年度に実施した研究内容について記載する。本研究の申請時に示した平成26年度の研究計画では、（１）Rho関連キナーゼの新規標的分子の網羅的探索、（２）Rho関連キナーゼの遺伝子欠損マウス作製、（３）心不全マウスモデルを用いた評価の3つである。それぞれの項目について進捗状況を記載する
（１）Rho関連キナーゼの新規標的分子の網羅的探索：Rho関連キナーゼをGST結合タンパク質として精製し、心臓の溶解液と混合し、キナーゼに結合した分子を質量分析法により同定した。これまでにRho関連キナーゼの標的分子として報告されていない、新規標的分子を明らかにしている。また、リン酸化部位を同定しており、同部位に対するリン酸化抗体を作製している。
（２）Rho関連キナーゼの遺伝子欠損マウス作製：Rho関連キナーゼには複数のアイソフォームが報告されており、定量性ＰＣＲ法を用いて、心筋細胞に高発現するRho関連キナーゼのアイソフォームを2種、明らかにした。2種類のアイソフォームについて、それぞれ、遺伝子欠損マウスを作製している。遺伝子欠損マウスはtamoxifenを投与することによりRho関連キナーゼが心筋特異的に欠損されるシステムになっている。平成26年度中にtamoxifen誘導性、心筋特異的Rho関連キナーゼ欠損マウスの作製を終了している。現在、2種類のアイソフォームともに欠損されている、ダブルノックアウトマウスを作製中である。
（３）心不全マウスモデルを用いた評価：tamoxifen誘導性Rho関連キナーゼ欠損マウスに浸透圧ポンプを用いて、アンギオテンシンIIを4週間投与した。コントロールマウスでは心肥大を認めたが、遺伝子欠損マウスでは心肥大が抑制されているデータを得ている。解析数が少ないため、今後、解析数を増やして、さらに検討する。

Strategy for Future Research Activity

本研究の今後の研究計画について記載する
（１）アンギオテンシンII負荷心不全モデル：平成26年には、Rho関連キナーゼのアイソフォームを1種類ずつ欠損させたマウスを用いて心肥大について評価を行ったが、現在、2種類のアイソフォームを欠損させたダブルノックアウトマウスを準備している。ダブルノックアウトマウスにより、心不全がさらに改善されるかを検討する。心重量による心肥大の評価に加え、心臓超音波検査による心機能評価、ANP・BNPなどの心不全関連因子の測定などを行い、Rho関連キナーゼを心不全の関わりについて、さらに検討を行っていく。
（２）圧負荷心不全モデル：マウス心不全モデルのスタンダードモデルであるTAC術（transverse aortic constriction）を行い、圧負荷心不全におけるRho関連キナーゼの働きについても検討を行う。アンギオテンシンII負荷モデルでは比較的短期間（4週間前後）の評価が主であるが、TAC術モデルではより長期な評価（最大1年間）を予定している。長期に評価することにより慢性心不全に認められる心拡大とRho関連キナーゼの評価を行う。
（３）リン酸化の細胞生物学的意義の解明：平成26年度の同定したRho関連キナーゼの新規標的分子のリン酸化の働きについて、細胞生物学的手法を用いて評価を行う。標的分子をクローニングし、リン酸化部位をアミノ酸置換し、その影響について評価を行う。標的分子が転写因子の制御に関わっている報告もあり、リン酸化により心不全関連遺伝子の発現が促進もしくは抑制されるかを検討し、また、その制御メカニズムについても検討する。

Causes of Carryover

平成26年度内にリン酸化抗体作製終了予定であったが、精製作業の一部を平成27年度に行うことになったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

リン酸化抗体精製に必要な試薬を購入する予定である。