2014 Fiscal Year Research-status Report
脂肪由来幹細胞を応用した骨軟部腫瘍切除後組織欠損の再生医療と蛍光イメージング評価
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26462271
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
林 克洋 金沢大学, 大学病院, 助教 (80507054)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 骨軟部腫瘍 / 脂肪由来幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
異型脂肪腫様腫瘍（以下、ALT）ではMDM2遺伝子（以下、MDM2）の増幅がある。MDM2の増幅はp53機能の低下を来たすと考えられる。p53は幹細胞において脂肪や骨分化を抑制するため、ALT由来間葉系幹細胞（以下、MSC）は脂肪や骨分化能が高いと予想される。p53機能の低下する多くの腫瘍で、腫瘍の幹細胞に対する分化誘導療法が有効か、ALTを代表として用いて探った。臨床的、病理形態学的にALTと診断した患者5人からALT組織と正常脂肪組織を採取し、各組織からMSCを作成した。それぞれのMSCで、MDM2のmRNA定量、gDNAのコピー数多型解析をリアルタイムPCRで行った。また、脂肪および骨分化能を比較した。前者はオイルレッドO染色後、抽出液の吸光度を測定しStudent's t検定で評価した。骨分化能はALP染色およびアリザリンレッドS染色後にマクロ写真からImage Jを用いて特定色域面積を測定し、正常脂肪由来MSCの平均値に対する比に換算しマンホイットニー検定で評価した。ALT由来MSCで、MDM2のmRNAの増加やgDNAのコピー数多型は認めなかった。分化能の比較では、脂肪分化能（正常脂肪対ALT）は5症例で各 0.29対0.29 (p=0.99)、0.16対0.13、0.52対0.41、0.36対0.20、0.44対0.28 (p＜0.05) であった。骨分化能は、ALP染色で1対2.9、対4.6、対2.9、対90.4、対0.001 (p＜0.01)。アリザリンレッドS染色で1対0.69、対5.13、対12.09、対3.59、対0.65 (p＜0.01) であった。分化能の比較では、脂肪分化能は正常脂肪由来MSCで、骨分化能はALT由来MSCで高い傾向があった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度から金沢大学に転勤となったが、金沢大学医学倫理審査委員会で患者からの脂肪採取の承認がとれ、順調に実験は継続できている。採取組織の違いにより、脂肪由来幹細胞の分化能の違いが確認できた。分化能が違うことの根拠がMDM2やp53の発現から説明できる可能性が示唆された。新環境での研究体制の立ち上げに若干時間がかかったため、幹細胞シート培養の分化促進や動物実験に関しては翌年に行うこととなったため研究費を繰越とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、症例数を増して確認するとともに、培養前組織のMDM2増幅細胞の確認、p53やMDM2蛋白の定量を含めた分化能の差異のメカニズム解析が必要と考える。また、骨分化に有利なシート培養もすすめていき、in vivoも含めた分化効率の向上をめざす。前年度の研究を継続し、症例数を増して確認するとともに、培養前組織のMDM2増幅細胞の確認、p53やMDM2蛋白の定量を含めた分化能の差異のメカニズム解析が必要と考える。p53関連遺伝子による分化能の違いより、関連遺伝子のノックダウン、導入などを検討する。これらのデーターより、骨軟部組織再生に最適な移植方法を見極めてゆく。骨分化に有利なシート培養もすすめていき、in vivoも含めた分化効率の向上をめざす。同時に安全性の確認で、腫瘍化の有無などを確認する。組織再生の確認は、移植部の組織を摘出してHE染色、免疫組織化学染色で行う。また、脂肪由来幹細胞の運命をみるため、蛍光イメージングを応用する。移植細胞をあらかじめPKH 26 redを用いて蛍光マーキングして移植することで、移植後のリアルタイムイメージング、摘出組織での移植細胞の残存、分化の確認を行う。
本研究の最終的な目的は、脂肪由来幹細胞などの体性幹細胞の治療の有効性と限界をみきわめることである。分化能力の有効性と同時に限界をみることは、ソースとしての役割をはっきりさせることであり、より安全かつ有効な細胞移植治療法の選択へと導くことができる。
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| Causes of Carryover |
当研究申請時は名古屋市立大学にて勤務していたが、今年度より金沢大学に転勤となった。研究体制のたちあげや、倫理委員会などの承認までに若干時間がかかった。幹細胞シートの分化促進実験や動物実験などを翌年に行うこととなり、その分研究費の使用が滞った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究計画は2年残っており、今年度分を挽回予定である。主に物品費に使用予定である。
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[Journal Article] A novel method to apply osteogenic potential of adipose derived stem cells in orthopaedic surgery2014
Author(s)
Fang X, Murakami H, Demura S, Hayashi K, Matsubara H, Kato S, Yoshioka K, Inoue K, Ota T, Shinmura K, Tsuchiya H.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 9
Pages: e88874
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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