2014 Fiscal Year Research-status Report
関節可動亢進型エーラス・ダンロス症候群の診断法の開発と発症機構の解明
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26462296
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
松本 健一 島根大学, 総合科学研究支援センター, 教授 (30202328)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | エーラス・ダンロス症候群 / テネイシンX / 過剰運動症候群 / 血清濃度測定 / ESI-TSQ質量分析計 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
関節可動亢進（III）型エーラス・ダンロス症候群（EDS）の分子レベルでの診断法の確立のために、III型EDSの原因遺伝子の一つとして知られているテネイシンX（TNX）の、血清中での正確な定量のために、エレクトロスプレーイオン化トリプルステージ四重極（ESI-TSQ）質量分析計による、テネイシンX（TNX）定量系の構築を行った。健常人血清（TNX+/+血清）、ELISA測定によりTNX値が約半減している方の血清（TNX+/-血清）、そしてIII型EDSと類似の臨床所見を示す過剰運動症候群（HMS)の患者（HMS/III型EDS患者）の内、TNXが欠損した患者からの血清（TNX-/-血清）を用いて、主要な12種類のタンパク質をアフィ二ティー抗体で除去後、還元、アルキル化を行い、酵素処理を行い、それぞれのペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィー (SCX) で分画した。血清TNX をナノ液体クロマトグラフィータンデムマス質量分析（ナノLC-MS/MS） で定量するために、Pinpointソフトウエアを利用して、親イオンの質量電荷比が2価イオンで500から800になる候補ペプチドを選択し、トランジション、コリジョンエネルギーを質量分析計に設定した。SCXで分画した画分をナノLCで分離後、設定した条件で質量分析計により解析し、TNX正常血清で検出され、TNX -/-血清では検出されないペプチドをスクリーニングした。候補ペプチドの中で一つのペプチド（ペプチドA）が定量に使用可能であることが判明した。合成ペプチドAの、トランジション強度の順番やリテンションタイムは、内在性ペプチドのそれと同じであった。安定同位体標識したペプチドAを、TNX +/+血清、TNX+/-血清、およびTNX-/-血清の消化物に添加してTNXの定量を行った。TNX 欠損患者ではTNXは検出されなかった。
また、MALDI-TOF/TOF質量分析計による発現差異プロテオミクス解析を利用しての、HMS/III型EDS患者血清におけるTNX以外の病態バイオマーカーの同定を試み始めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ESI-TSQ質量分析計を用いたTNXの定量系の開発は予想以上に進んだ。また、野生型マウスの膝関節の腱や靭帯の組織切片を作製し、TNXの発現パターンを観察した。膝の腱においてTNXの線維状の発現が観察され、特に軟骨に近い部位の腱の基部において、TNXの高発現が観察された。一方、EDSの病態モデル動物として知られているTNX欠損（TNX-/-）マウスを用いての腱や靭帯の解析は少し手間取っている。TNX-/-マウスの膝付近の腱や靭帯を採取し、ex vivoの培養後線維芽細胞の培養を試みたが、十分量に増やすことができず、実験に供することができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度に構築したESI-TSQ質量分析計によるTNX定量測定系を用いて、他のHMS/III型EDS患者や型不明のEDS患者の血清中のTNXの定量を試みる。
また、HMS/III型EDS患者由来の血清サンプルを用いて、HMS/III型EDS患者血清におけるTNX以外の病態バイオマーカーの同定を試みる。まず、数名の健常人の血清を混ぜ、これをコントロール血清とする。次に、HMS/III型EDS患者血清サンプル、健常人血清サンプル、そしてコントロール血清を用いて、血清主要蛋白質除去カラムにより主要蛋白質を除く。次に各サンプルを、変性、還元、アルキル化後、トリプシン処理により分解を行う。その後、各サンプルを、異なる質量のレポーター領域を持つisobaric tag for relative and absolute quantitation （iTRAQ）試薬により標識を行う。標識された各サンプルを混ぜ、陽イオン交換クロマトグラフィーとナノLCシステムにより分画する。次に、MALDI-TOF/TOF質量分析計でMS/MS分析を行う。その分析結果に基づき、ProteinPilotソフトウエアを用いて、健常人血清と比較して、HMS/III型EDS患者血清において発現差異を示す蛋白質の同定と相対定量を行う。HMS/III型EDS血清で発現差異を示す血清蛋白質（病態バイオマーカー）の量的変動の確認を、別の患者血清を用いて、ウエスタンブロット等にて行う。
また、野生型マウスとTNX-/-マウスの付近の腱や靭帯を採取し、ex vivoでの線維芽細胞の培養を再度試みる。一方、腱や靭帯からの線維芽細胞が十分量得られない場合は、他の手段として、増殖力の高い胚性線維芽（MEF）細胞を各系統より調整し、それらを用いてフィブリンゲル三次元培養法にて培養し、ex vivoでのコラーゲン線維形成を調べる。
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| Causes of Carryover |
平成26年度にHMS/III型EDS患者由来の血清を用いて、健常人に比べて発現差異を示すTNX以外のHMS/III型EDS特異的血清蛋白質（病態バイオマーカー）の同定を試み出したが、この発現差異プロテオミクス解析に必須のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（MALDI-TOF/TOF）質量分析計に搭載のレーザー管の経年劣化のため、平成26年11月末にレーザー出力が不能となり、その質量分析計が稼働しなくなった。このレーザー管の修理には、約506万円という高額の修理費が必要で、その修理費の一部に、この88万円の繰越金の一部を充当することとした。このレーザー管の修理に当てる他の財源との都合上、レーザー管の修理は平成27年度早々に行われる予定である。また、この繰越金の一部を用いて、レーザー管の修理復旧後に必要となる生化学試薬等の物品購入も行う予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
MALDI-TOF/TOF質量分析計のレーザー管の修理完了後に、前述の「今後の研究の推進方策」に記載の通り、HMS/III型EDS患者由来の血清サンプルを用いて、TNX以外の病態バイオマーカーの同定を再開する。
また、平成26年度に構築したESI-TSQ質量分析計により、血清型TNX定量系を用いて、他のHMS/III型EDS患者や型不明のEDS患者の血清中のTNX量の測定を試みる。さらには、野生型マウスとTNX-/-マウスの付近の腱や靭帯を採取し、ex vivoでの線維芽細胞の培養を試みる。一方、腱や靭帯からの線維芽細胞が得られない場合は、増殖力の高い胚性線維芽（MEF）細胞を各系統より調整し、TNXの有無によるex vivoでのコラーゲン線維形成を調べる。
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Research Products
(13 results)
