2015 Fiscal Year Research-status Report
神経幹細胞の全身投与による虚血性内耳障害抑制効果の研究
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26462560
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
白馬 伸洋 帝京大学, 医学部, 教授 (70304623)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 内耳虚血 / 内有毛細胞 / 活性酸素 / therapeutic time window / 神経幹細胞 / 神経栄養因子 / 再生治療 / 全身投与 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
突発性難聴の原因は未だ不明であるが、多くの症例では背景に内耳虚血が関与すると考えられる。我々は長期生存可能な一過性内耳虚血の動物モデルを作成し、虚血・再灌流による内耳障害メカニズムやその防御法について研究を進めてきた。その結果、内耳虚血により20dB～40dBの難聴が生じ外リンパ中グルタミン酸濃度が著明に上昇すること、虚血後3日目までに有毛細胞にアポトーシスが生じ脱落が起こることを明らかにした。さらに神経幹細胞をスナネズミ一過性虚血モデルの内耳に虚血後注入し、虚血障害後に生じる内耳障害について生理的・組織的検討を行った結果、進行する内有毛細胞の脱落変性を抑制し、その治療効果を明らかにした。その機序として、虚血によりiNOSが誘導され、誘導されたiNOSによって蝸牛外リンパ液中にNOxが発生することや、free radicalが障害の増悪因子であること(Maetani2003)を証明してきた結果、therapeutic time window；治療効果が期待できる期間が存在しすることを解明した。
また、虚血性内耳障害に対する治療効果の研究においては、幹細胞の一つである神経幹細胞の蝸牛内投与により、虚血障害24時間の後投与であっても、4日後に生じる進行性の内有毛細胞障害を抑制する効果が確認され、臨床的にも急性感音性難聴が発症して治療までの間に一定の猶予期間が示されたことより、神経幹細胞を用いた難聴治療は将来の有用な治療法となる道筋が示されている。
本研究では上記の研究成果をふまえ、神経幹細胞の大腿静脈を介した全身投与よる虚血性内耳障害抑制効果の確認とそのメカニズムを分子レベルで探求することにより、内耳における神経幹細胞を用いた虚血性内耳障害に対する新しい再生治療の確立をめざす。また難聴防御に関連して、このtherapeutic time windowを考慮して、全身投与における虚血性内耳障害に対する神経幹細胞の障害抑制効果が認められる期間についても検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究代表者の異動があったが、もともとの研究施設である愛媛大学耳鼻咽喉科の岡田昌史講師が新たに共同研究者として本研究に加わり、研究の手助けをしてもらえることと、異動先の帝京大学医学部附属溝口病院より、月に一度週末の2日間の研究日をいただき、愛媛大学に研究に赴くことが可能となり、今まで通り愛媛大学耳鼻咽喉科の研究室を使用して研究が行えることから、平成27年度にはスナネズミの一過性内耳虚血モデルを用いて、スナネズミ胎児の海馬・線条体より採取・培養した神経幹細胞をスナネズミ一過性虚血モデルの大腿静脈に虚血後注入し、虚血障害後のコルチ器おけるiNOS発現を検討することを計画していたが、以下の実験方法にておおむね計画通りに進行している。
① スナネズミの虚血方法：経口挿管後に両側椎骨動脈に糸をかけて滑車につるした後に他端に5gの重りをかけ、虚血を負荷する。虚血中は人工呼吸器で呼吸管理を行い15分の虚血後に糸をはずし、一過性内耳虚血を行った。
② 蝸牛鼓室階のNOx濃度の測定：血後虚の細胞障害メカニズムの1つと考えられているNOxの濃度およびNOSの活性について、神経幹細胞を蝸牛内投与した場合にはどのように変化しているかを実際にNOxの濃度測定を行った。方法であるが、経時的な鼓室階外リンパ中のNOx濃度を微小透析法と窒素分析システムを用いて測定した。微小透析膜とマイクロシリンジポンプオートインジェクターシステムを用い、透析液を参加窒素分析装置に送ることによりリンパ球中のNO2-、NO3-の濃度を0.1 pmolの検出感度でin vivoで測定した。
③ コルチ器おけるiNOS発現の組織学的検討：コルチ器におけるiNOSの発現を観察した。方法であるが、神経幹細胞投与群と非投与を比較検討し、NOx測定後の蝸牛コルチ器切片をウサギiNOS抗体で染色、その発現と活性の局在の観察を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、神経幹細胞全身投与の内耳虚血障害に対する抑制効果のメカニズムを分子レベルで解析するためさらに以下の項目について検討予定である。
① 神経幹細胞全身投与での障害抑制効果が認められる期間について検討：難聴防御に関連して、therapeutic time window；治療効果が期待できる期間を考慮して、虚血性内耳障害に対する神経幹細胞の障害抑制効果が認められる期間についても検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
当研究は共同研究施設の愛媛大学医学部耳鼻咽喉科教室にて動物実験を行っています。最終年度の共同研究で使用する動物およびその飼育料、実験の試薬料、備品料については本科研費で支払う予定であるため、次年度の使用額として準備していることから繰越金が生じました。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
共同研究施設の愛媛大学医学部耳鼻咽喉科教室にて、共同研究で使用する動物およびその飼育料、実験の試薬料、備品料として用いる予定である。
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