2014 Fiscal Year Research-status Report

細胞内シグナル伝達物質ｃ－ｄｉ－ＧＭＰに着目した抗菌薬抵抗性メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	26462787
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	村上圭史徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (10335804)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	弘田克彦徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 准教授 (60199130) 三宅洋一郎徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (80136093)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	緑膿菌 / 抗菌薬抵抗性 / c-di-GMP / 付着菌 / バイオフィルム
Outline of Annual Research Achievements	慢性難治性感染症の代表的な例として，バイオフィルム感染症が問題となっている。バイオフィルム形成菌は抗菌薬や消毒薬に対し，抵抗性を示すことがその理由として考えられており，我々は，バイオフィルム形成以前の付着細菌が抗菌薬抵抗性を獲得していることを見出している。しかし，そのメカニズムは不明である。また近年，細胞内セカンドメッセンジャーであるc-di-GMPがバイオフィルム形成に重要な役割を果たすことから注目されており，本研究では，c-di-GMPと抗菌薬抵抗性の関連を明らかとすることを目的としている。 1. 付着による遺伝子発現の変動：付着による遺伝子発現の変動を解析するため，６ウェル平底プレートに遠心操作により，細菌を付着させ，付着菌を回収し，RT-PCRを行った。抗菌薬抵抗性に関与する可能性のある約２０個の遺伝子を解析したところ，付着により遺伝子発現が誘導されたものが見つかった。 2. リアルタイムイメージング法による抗菌薬抵抗性の解析：c-di-GMPに制御され，抗菌薬抵抗性に重要な役割を果たしているpsl遺伝子について，その欠損株では，マウスを使った感染実験でも，抗菌薬に対する抵抗性が低下していることが明らかとなった。 3. c-di-GMP定量法の確立：LC-MSよりも簡便なc-di-GMPの定量法を確立するため，c-di-GMPにキャリア蛋白を結合し，マウスに免疫を行ったが，c-di-GMPに対する抗体価の上昇は見られなかった。そこで，c-di-GMPに対するDNAアプタマーのスクリーニングを行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 1. 付着菌による遺伝子発現の網羅的な解析付着菌による遺伝子発現の変動を網羅的に解析するために，当初は，まずマイクロアレイによる解析を行う予定であった。しかしながら，実際に実験を行う中で，マイクロアレイ解析に必要なRNA量を，付着菌より回収することは，非常に困難であることが判明したため，現在は，これまでのスクリーニングなどで得られたデータをもとに，抗菌薬抵抗性に関連している考えられる遺伝子について，付着の影響について，RT-PCRにより解析を進めていく予定にしている。 2. ２成分制御系，c-di-GMP合成，分解系遺伝子欠損株ライブラリーの作製２成分制御系が付着の認識に関与していると推測されるものの，その候補は64個，またc-di-GMPの合成，分解に関与する遺伝子は３８個存在しており，欠損株を作製し，表現系を解析する予定であるが，現在，２成分制御系が３個，c-di-GMP合成，分解系は９個の変異株を作製している。今後，さらに，変異株の作製を進めていく予定にしている。
Strategy for Future Research Activity	これまでの結果から，付着により多くの遺伝子の発現が変動することは確認されたため，今後は，さらに多くの遺伝子の発現解析をおこない，付着により，菌体内でどのような経路が活性化されるのかを詳細に検討する予定である。また，付着を認識するセンサーや，それに連動して，誘導されるc-di-GMPの合成，または分解に関与する遺伝子を，ノックアウト変異株を作製し，検討する予定にしている。候補となる遺伝子の数が膨大であるため，RT-PCR等の結果を参考に，ある程度候補を絞り込みながら，進めていく予定である。また，c-di-GMPに対するDNAアプタマーを探索し，より簡便な菌体内c-di-GMPの定量法を開発する予定にしている。
Causes of Carryover	付着菌による遺伝子発現の変動を測定するため，マイクロアレイを用いた解析を行う予定であったが，total RNA量の不足により，解析を行うことが出来なかったために，予定額を使用しなかった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	繰越額と合わせた平成２７年度の直接経費は，リアルタイムPCR等の遺伝子発現の解析，分子生物学実験用試薬類，細菌培養用実験の消耗品等を購入する。また，研究成果発表のための学会等への出張旅費，研究打ち合わせのための旅費に使用する。