2015 Fiscal Year Research-status Report
細胞内シグナル伝達物質ｃ－ｄｉ－ＧＭＰに着目した抗菌薬抵抗性メカニズムの解明
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26462787
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
村上 圭史 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 助教 (10335804)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
弘田 克彦 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 准教授 (60199130)
三宅 洋一郎 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (80136093)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 緑膿菌 / 抗菌薬抵抗性 / c-diGMP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
慢性難治性感染症の代表的な例として，バイオフィルム感染症が問題となっている。バイオフィルム形成菌は抗菌薬や消毒薬に対し，抵抗性を示すことがその理由として考えられており，我々は，バイオフィルム形成以前の付着細菌が抗菌薬抵抗性を獲得していることを見出している。しかし，メカニズムは不明である。近年，細胞内セカンドメッセンジャーであるc-di-GMPがバイオフィルム形成に重要な役割を果たすことから注目されており，本研究では，c-di-GMPと抗菌薬抵抗性の関連を明らかとすることを目的としている。
1) c-di-GMP定量法の確立
現在確立されているc-di-GMPの定量法は，LC-MS法のみであり，これよりも簡便なc-di-GMPの定量法を確立するため，リボザイムに着目し，c-di-GMPに特異性の高いRNA分子を用いることで，定量法の確立に成功した。
2) ２成分制御系，c-di-GMP合成，分解系遺伝子欠損株ライブラリーの作製
２成分制御系が付着の認識に関与していると推測されるものの，PAO1ゲノムデータベースによると，その候補となる遺伝子は64個，またc-di-GMPの合成，分解に関与する遺伝子は３８個存在している。現在，２成分制御系が8個，c-di-GMP合成，分解系は12個の変異株を作製し，現在抗菌薬抵抗性との関連について検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1) c-di-GMP定量法の確立：現在確立されているLC-MS法よりも優れたc-di-GMPの定量法の確立を目的とし，リボザイムを応用したc-di-GMPの新規定量法の確立に成功した。菌体からのサンプル抽出法や，菌体量による補正方法などについては，まだ改善の余地があるため，現在，より正確な定量法の確立に向けて，プロトコールの改善を行っている。
2) ２成分制御系，c-di-GMP合成，分解系遺伝子欠損株ライブラリーの作製：現在，２成分制御系が8個，c-di-GMP合成，分解系は12個の変異株を作製し，表現系の解析を行っている。今後さらに欠損株のライブラリーを増加し，解析を継続して行く予定である。
3) 臨床分離株のスクリーニング：当研究室で保有している，緑膿菌臨床分離株３００株の中で，付着菌での抗菌薬抵抗性が低下している株を数株スクリーニングにより見出すことに成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの結果から，菌体内c-di-GMP濃度の新たな定量法の確立に成功した。この方法をより精度の高い方法に改善し，今後は，これまでに作成した，ノックアウト株を用いて，c-di-GMP量の定量を行い，抗菌薬抵抗性との関連を検討する予定である。さらに，臨床分離株において，抗菌薬抵抗性が低下している株についても，c-di-GMPの定量を行う予定にしている。また，２成分制御系と，c-di-GMPの合成，または分解に関与する遺伝子について，ノックアウト株の作製を継続し，網羅的に解析を行う予定である。さらに，付着により発現が変動することは確認されたため，今後は，それらの遺伝子の中で，抗菌薬抵抗性に関与する遺伝子を解析し，付着により，菌体内でどのような経路が活性化されるのかを詳細に検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
研究成果の発表のために，海外での学会発表を計画していたが，実験データがまだ十分ではないために，発表を行うことが出来なかったために，予定額を使用しなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰越額と合わせた平成２７年度の直接経費は，リアルタイムPCR等の遺伝子発現の解析，分子生物学実験用試薬類，細菌培養用実験の消耗品等を購入する。また，研究成果発表のための学会等への出張旅費，研究打ち合わせのための旅費に使用する。
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