2014 Fiscal Year Research-status Report
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26462791
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
後藤 哲哉 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (70253458)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片岡 真司 九州歯科大学, 歯学部, 助教 (80364149)
山中 淳之 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (80343367)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 象牙芽細胞 / アデノシン３リン酸 / VNUT / 温熱刺激 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は象牙芽細胞のATP分泌に関与していると考えられるVNUTに関して、VNUTの発現、放出経路、ストレス（温熱刺激）時の象牙芽細胞からのATPの放出を確認することを目的として研究を行った。
In vivo実験では７週齢SDラットを4%パラホルムアルデヒドで灌流固定を行い、上顎臼歯を上顎骨とともに取り出し、１晩浸漬固定を行ったあと、10%EDTA溶液にて３週間脱灰を行った。免疫蛍光染色としては、抗VNUT抗体、抗SNAP25抗体、抗P2X3受容体抗体等を使って、象牙芽細胞および象牙芽細胞近傍の神経線維における局在を明らかにした。In vitro実験では象牙芽細胞様細胞KN-3細胞を用い、NK-3細胞がコンフルエントになる前まで細胞を増殖させ、種々の時間を設定して６０度程度の温熱刺激を加えKN-3細胞より培地中に放出されるATPの濃度を調べるとともに、ATPの放出が見られた状態で、VNUTの発現変化についてもRT-PCR法、免疫染色法を用いて調べた。
結果、象牙芽細胞に顆粒状に見えるVNUT抗体陽性免疫反応が認められた。象牙芽細胞層の象牙芽細胞間には歯髄からの神経線維が認められ、神経線維にはP2X3抗体陽性反応が局在していた。また、象牙芽細胞内ではVNUT陽性反応とSNAP25陽性反応の共局在が認められたことは、VNUTにより小胞内に集められたATPが細胞膜に癒合し細胞外に放出されている事が示唆された。象牙芽細胞様細胞NK-3細胞にはVNUT免疫陽性反応が認められた。またNK-3細胞は温熱刺激により細胞外の培養液中のATP濃度が、刺激のない状態に比べ有意に上昇が認められた。また、NK-3細胞に温熱刺激を与える事によりVNUT mRNA発現の上昇が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予想通り象牙芽細胞内にATPトランスポーターであるVNUTの発現が確認され、温熱刺激により象牙芽細胞様細胞にVNUTの発現が上昇するとともに、細胞外のATP濃度の上昇が確認できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、蛍光顕微鏡レベルでの象牙芽細胞中のVNUTの局在が確認できたが、今後は電子顕微鏡レベルでのVNUTの局在を調べる。また、象牙芽細胞にin vivoで歯を削合するなどの刺激を与えたのち象牙芽細胞のVNUT陽性小胞の量的な変化があるかどうかを調べる。
In vitro実験では、ATP放出の方法としてVNUTの小胞分泌によるもの、ATPチャネルによるもの、ギャップ結合を介しての放出が考えられるので、それぞれの放出阻害剤を用いてATPの放出がVNUT小胞分泌が主である事を調べる。
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Research Products
(2 results)
