CCN2による骨細胞機能を標的とした新規骨粗鬆症治療薬の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462810
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 西田 崇 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (30322233)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 滝川 正春 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (20112063) ; 久保田 聡 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (90221936) ; 服部 高子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (00228488) ; 青山 絵理子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (10432650)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: CCN2/CTGF / 骨細胞 / 初代骨細胞様細胞 / 3次元培養 / 薬剤誘導性Ccn2欠損マウス / 破骨細胞形成

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題の目的はCCN family protein 2/結合組織成長因子(CCN2/CTGF)によって骨のリモデリング時に司令塔として働く骨細胞がどのような影響を受けるのかを骨細胞を介した破骨細胞形成の観点から解析することで、新規骨粗鬆症治療薬開発の可能性を検討することである。平成27年度は平成26年度に作製したタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウスの大腿骨からコラゲナーゼによる段階消化によって骨細胞様細胞を単離し、以下の解析を行った。(1) コラゲナーゼによる段階消化によって骨細胞様細胞が単離できているかを確認するために、骨細胞のマーカー分子の一つであるSost遺伝子の発現レベルを調べた結果、単離した骨細胞様細胞にSost遺伝子が非常に高く発現していることを確認した。(2) タモキシフェンを投与してもCCN2が欠失しないマウスから単離した骨細胞様細胞を対照群にして、2群の細胞をそれぞれコラーゲンゲル内で3次元培養し、細胞突起の伸長に影響が見られるかを調べたところ、CCN2の欠失に関係なく骨細胞様細胞の細胞突起の伸長は2群の細胞間で影響は見られず、共に十分細胞突起は伸長した。 (3) 3次元培養した骨細胞様細胞上にマウスマクロファージ系細胞株RAW264.7を播種し、GST融合RANKL (GST-RANKL)で破骨細胞形成を誘導すると、CCN2を欠失させた骨細胞様細胞上で破骨細胞形成を誘導した群で破骨細胞分化に必須の転写因子であるNFATc1と分化マーカー分子の一つであるカテプシンKの産生量が対照群と比較して共に減少した。(4) タモキシフェン投与によってCCN2を欠失させたマウス大腿骨の組織切片を作製すると、CCN2を欠失させていない対照群と比較して大腿骨の骨梁の減少が見られた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成27年度の研究目的はタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウス由来の骨細胞様細胞の機能解析に主眼をおいているため、同マウスから単離した骨細胞様細胞を用いて、骨細胞を介した破骨細胞形成の低下を明らかにした点及びタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウスの大腿骨を採取し、組織化学的解析によって、大腿骨梁の減少を明らかにした点で、概ね本課題は順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度は老齢期に達したタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウスの表現型を解析することを目的としている。タモキシフェン投与によってCCN2を欠失させたマウスを老齢期まで飼育した後に、骨組織への影響をマイクロCT及び免疫組織化学的研究手法により解析する。また、平成27年度では破骨細胞形成の影響をマウスマクロファージ系細胞株RAW264.7を用いて解析したが、平成28年度ではRAW264.7細胞の代わりにタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウスの骨髄細胞を使って、破骨細胞形成への影響を調べる予定である。加えて、平成28年度は本課題の最終年度であるため、これまでの実験結果をまとめ、成果発表の準備を行う。

Causes of Carryover

平成27年度の実験計画の当初予定としてタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウスの骨組織をマイクロCTを用いて解析する計画であったが、先に組織切片を作製し、組織化学的にその表現型を観察した。そのため、マイクロCT撮影用に計上していた金額が余剰したためである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成28年度は、平成27年度にできなかったタモキシフェン誘導性CCN2欠損マウスの骨組織のマイクロCT撮影及び組織化学的な解析を行っていく予定である。平成28年度が本課題研究の最終年度のため、平成28年度に請求する金額と当該金額を合わせて本研究課題を遂行する予定である。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Department of Orthopedic Surgery, UCLA,/Department of Oral Biology, UMKC(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: Department of Orthopedic Surgery, UCLA,/Department of Oral Biology, UMKC
• [Journal Article] Role of CCN2 in amino acid metabolism of chondrocytes. (2016)
  • Author(s): Murase, Y,, Hattori, T., Aoyama, E., Nishida, T., Maeda-Uematsu, A., Kawaki, H., Lyons, K. M., Sasaki, A., Takigawa, M., Kubota, S.
  • Journal Title: J. Cell Biochem. Volume: 117 Pages: 927-937
  • DOI: 10.1002/jcb.25377. Epub 2015 Sep 22.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Involvement of multiple CCN family members in platelets that support regeneration of joint tissues. (2016)
  • Author(s): Hara, C., Kubota, S., Nishida, T., Hiasa, M., Hattori, T., Aoyama, E., Moriyama, Y., Kamioka, H., Takigawa, M.
  • Journal Title: Mod. Rheumatol. Volume: なし Pages: 1-10
  • DOI: 10.3109/14397595.2016.1155255
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Production of recombinant CCN2 protein by mammalian cells. (2016)
  • Author(s): Nishida, T., Kubota, S., Takigawa, M.
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology: CCN Proteins: Methods and Protocols Volume: 未定 Pages: in press
• [Journal Article] Cell biological assays for measuring chondrogenic activities of CCN2 protein. (2016)
  • Author(s): Nishida, T., Kubota, S., Takigawa, M.
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology: CCN Proteins: Methods and Protocols Volume: 未定 Pages: in press
• [Journal Article] In vivo evaluation of cartilage regenerative effects of CCN2 protein. (2016)
  • Author(s): Nishida, T., Kubota, S., Takigawa, M.
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology: CCN Proteins: Methods and Protocols Volume: 未定 Pages: in press
• [Journal Article] CCN2 enhances RANKL-induced osteoclast differentiation via direct binding to RANK and OPG. (2015)
  • Author(s): Aoyama, E., Kubota, S., Khattab, H. M., Nishida, T., Takigawa, M.
  • Journal Title: Bone Volume: 73 Pages: 242-248
  • DOI: 10.1016/j.bone.2014.12.058. Epub 2014 Dec 30.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] CCN family protein 2 (CCN2) promotes the early differentiation, but inhibits the terminal differentiation of skeletal myoblasts. (2015)
  • Author(s): Nishida, T., Kubota, S., Aoyama, E.,Janune, D., Lyons, K.M., Takigawa, M.
  • Journal Title: J Biochem. Volume: 157 Pages: 91-100
  • DOI: 10.1093/jb/mvu056. Epub 2014 Sep 26.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] New functional aspects of CCN2 revealed by trans-omic approaches. (2015)
  • Author(s): Kubota, S., Maeda-Uematsu, A., Nishida, T., Takigawa, M
  • Journal Title: J. Oral Biosci. Volume: 57 Pages: 37-43
  • DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.job.2014.09.002
• [Presentation] 軟骨細胞形成を支える長鎖非コードRNA。 (2016)
  • Author(s): 石川崇典、久保田聡、村瀬有里香、西田 崇、服部高子、滝川正春
  • Organizer: 第29回日本軟骨代謝学会
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 2016-02-19 – 2016-02-20
• [Presentation] CCN2産生を誘導するセロトニンの軟骨細胞内でのシグナル伝達機構の解析。 (2016)
  • Author(s): 堀 綾花、西田 崇、高柴正悟、久保田聡、滝川正春
  • Organizer: 第29回日本軟骨代謝学会
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 2016-02-19 – 2016-02-20
• [Presentation] 骨細胞の作用を介した破骨細胞形成におけるCCN2の役割。 (2015)
  • Author(s): 西田 崇、久保田聡、服部高子、Bonewald, L. F.、 滝川正春
  • Organizer: 第38回分子生物学会年会・第88回生化学会大会合同大会BMB2015
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] Induction of CCN2 by low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) in cultured chondrocytes and its biological significance. (2015)
  • Author(s): Nishida, T., Kubota, S., Aoyama, E., Yamanaka, N., Lyons, K. M., Takigawa, M.
  • Organizer: Eight International Workshop on the CCN Family of Genes
  • Place of Presentation: Nice, France
  • Year and Date: 2015-11-03 – 2015-11-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Metabolic impacts of CCN2 in chondrocytes. (2015)
  • Author(s): Kubota, S., Murase, Y., Maeda-Uematsu, A., Hattori, T., Aoyama, E., Nishida, T., Kawaki, H., Lyons, K. M., Takigawa, M.
  • Organizer: Eight International Workshop on the CCN Family of Genes
  • Place of Presentation: Nice, France
  • Year and Date: 2015-11-03 – 2015-11-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Role of interaction between CCN2 and Rab14 in vesicle trafficking in chondrocytes novel intracellular function of CCN2. (2015)
  • Author(s): Hoshijima, M., Hattori, T., Aoyama, E., Nishida, T., Kubota, S., Kamioka, H., Takigawa, M.
  • Organizer: Eight International Workshop on the CCN Family of Genes
  • Place of Presentation: Nice, France
  • Year and Date: 2015-11-03 – 2015-11-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Regenerative effects of CCN2 ondependent modules and CCN3 on articular chondrocytes/cartilage. (2015)
  • Author(s): Takigawa, M., Abd El Kader, T., Janune, D., Aoyama, E., Nishida, T., Hattori, T., Hara, E. S., Ono, M., Tabata, Y., Kuboki, T., Kubota, S.
  • Organizer: Eight International Workshop on the CCN Family of Genes
  • Place of Presentation: Nice, France
  • Year and Date: 2015-11-03 – 2015-11-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] CCN2は骨細胞を介して破骨細胞形成を制御する。 (2015)
  • Author(s): 西田 崇、久保田聡、服部高子、滝川正春
  • Organizer: 第57回歯科基礎医学会
  • Place of Presentation: 新潟
  • Year and Date: 2015-09-11 – 2015-09-13
• [Presentation] CCN2とRab14の相互作用が軟骨細胞の小胞輸送に及ぼす役割 ～軟骨分化促進因子CCN2の新たな細胞内機能～。 (2015)
  • Author(s): 星島光博、服部高子、青山絵理子、西田 崇、久保田聡、上岡 寛、滝川正春
  • Organizer: 第57回歯科基礎医学会
  • Place of Presentation: 新潟
  • Year and Date: 2015-09-11 – 2015-09-13
• [Presentation] Introducing CCN2 independent modules as a regenerative therapy for osteoarthritis and futher selecting the most suitable among them. (2015)
  • Author(s): Abd El-Kader, T., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Hara, E. S., Ono M., Tabata, Y., Kuboki, T., Kubota, S., Takigawa, M.
  • Organizer: 第7回日本CCNファミリー研究会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 2015-08-29 – 2015-08-29
• [Presentation] CCN2の新たな細胞内機能 : CCN2 とRab14の相互作用が軟骨細胞の小胞輸送に及ぼす役割。 (2015)
  • Author(s): 星島光博、服部高子、青山絵理子、西田 崇、久保田聡、上岡 寛、滝川正春
  • Organizer: 第7回CCNファミリー研究会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 2015-08-29 – 2015-08-29
• [Presentation] CCN2による軟骨細胞アミノ酸代謝制御機構の解明。 (2015)
  • Author(s): 村瀬有里香、服部高子、青山絵理子、西田 崇、前田 彩、川木晴美、Lyons, K. M., 佐々木朗、滝川正春、久保田聡
  • Organizer: 第7回CCNファミリー研究会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 2015-08-29 – 2015-08-29
• [Presentation] 関節軟骨におけるCCN3の新機能。 (2015)
  • Author(s): ジャヌネ ダニーロ、Abd El-Kader, T., 青山絵理子、西田 崇、久保田聡、滝川正春
  • Organizer: 第7回CCNファミリー研究会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 2015-08-29 – 2015-08-29
• [Presentation] CCN2は骨細胞に作用し、破骨細胞を正に制御する。 (2015)
  • Author(s): 西田 崇、久保田聡、服部高子、Bonewald, L. F., 滝川正春
  • Organizer: 第7回CCNファミリー研究会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 2015-08-29 – 2015-08-29
• [Presentation] 破骨細胞形成を制御する骨細胞に与えるCCN2の作用。 (2015)
  • Author(s): 西田 崇、久保田聡、滝川正春
  • Organizer: 第33回日本骨代謝学会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-07-23 – 2015-07-25
• [Presentation] 関節軟骨におけるCCN3の新機能。 (2015)
  • Author(s): ジャヌネ ダニーロ、Abd El-Kader, T., 青山絵理子、西田 崇、Khattab, H., 久保田聡、滝川正春
  • Organizer: 第33回日本骨代謝学会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-07-23 – 2015-07-25
• [Presentation] CCN2による軟骨細胞のアミノ酸代謝制御。 (2015)
  • Author(s): 村瀬有里香、服部高子、青山絵理子、西田 崇、前田 彩、川木晴美、佐々木朗、滝川正春、久保田聡
  • Organizer: 第33回日本骨代謝学会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-07-23 – 2015-07-25
• [Presentation] 軟骨細胞アミノ酸代謝とCCN2。 (2015)
  • Author(s): 村瀬有里香、服部高子、青山絵理子、西田 崇、前田 彩、川木晴美、Lyons, K. M.、佐々木朗、滝川正春、久保田聡
  • Organizer: 第6回骨バイオサイエンス研究会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 2015-07-04 – 2015-07-04
• [Remarks] 岡山大学歯学部口腔生化学分野
  • URL: www.okayama-u.ac.jp/user/seika/index.html