2014 Fiscal Year Research-status Report
培養オルガノイド由来パネト細胞を用いた口腔細菌と腸管自然免疫のクロストーク解明
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26462831
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
中村 公則 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 准教授 (80381276)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 自然免疫 / Paneth細胞 / αディフェンシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
口腔と腸管は解剖学的に連続しており口腔常在菌や歯周病菌などの病原菌が腸管の細菌叢や機能に影響を及ぼすことは容易に考えられる。しかし、今日までに口腔常在菌・病原菌の腸管への影響を自然免疫の観点から詳細に検討した報告はない。この理由として、in vitroで基礎的検討を実施することが出来る適切な腸上皮細胞株が存在していないことと、定量的かつ簡便な自然免疫学的評価法が確立されていないことが考えられる。そこで本研究では組織構造体 (オルガノイド)培養法を応用して、小腸上皮を構成し、腸管自然免疫の主要エフェクターである抗菌ペプチド・αディフェンシンを分泌し自然免疫や腸内細菌叢の恒常性維持に寄与しているPaneth（パネト）細胞の株化を目標とする。得られたパネト細胞株に口腔常在菌や口腔病原菌を暴露し、その培養上清を申請者が開発したαディフェンシンに高感度で特異性の高いsandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)を用いてαディフェンシン量を測定する。さらには、細胞株の遺伝子的変化を解析することで自然免疫機構の評価を行う。本研究は、口腔常在菌・病原菌の腸管における自然免疫系と細菌叢へのクロストークをαディフェンシンの分泌と殺菌機能および分子機構の両面から定量的に評価することで、口腔細菌による生活習慣病などの疾患発症のメカニズム解明を目的とし、研究期間内に①オルガノイド培養法を応用したパネト細胞株の樹立、 ②口腔細菌の小腸上皮細胞・パネト細胞への影響の検討、を実施する。平成26年度は、マウス小腸上皮オルガノイド培養法を確立するために最適な培養条件を検討し、さらに得られたオルガノイドがパネト細胞を含み、それが刺激物質によりαデフェンシンを分泌するのかを検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度は、オルガノイド培養法を応用したパネト細胞株の樹立することを目的として、最初に、マウス小腸上皮細胞オルガノイドの最適な培養条件を検討した。既に報告のある培養法を参考にして (Sato T, et al, Nature, 2011)、マウス小腸空腸より組織を切除し、EDTA溶液で処理後、陰窩を分離して細胞外基質ゲルに包埋し無血清培地にて培養を行った。培養開始から数時間で陰窩は円形状になり、2日後には陰窩構造部分の突出が観察された。培養開始5日目には、陰窩構造部分基底部にパネト細胞の特徴である、細胞質中に大きな顆粒を豊富に保持している細胞が数個観察できた。得られたオルガノイドを抗マウスαディフェンシン抗体にて免疫蛍光染色を行ったところ、陰窩構造部分基底部の細胞内に存在する顆粒が陽性だった。さらに、オルガノイドの培養中にパネト細胞顆粒分泌を刺激するこで知られているコリン作動薬カルバコールを添加し、2時間後に培養上清を回収し、sandwich ELISAを用いてαディフェンシン量を測定したところ未処理と比較して、オルガノイド1個あたり約３倍の分泌量を示した。以上より、培養条件の検討により得られたオルガノイドはパネト細胞を保持しており、顆粒分泌機能を維持していることが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度は、引き続きパネト細胞の株化を目標とする。
①オルガノイドからのパネト細胞の分離。オルガノイドを構成する上皮細胞（吸収上皮細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、腸上皮幹細胞、パネト細胞）よりパネト細胞のみの分離を試みる。実際には、オルガノイドをコラゲナーゼで細胞単位に分離後、パネト細胞と小腸上皮幹細胞の表面マーカーとして知られているCD24を認識するモノクロ-ナル抗体と反応させ、フローサイトメーターにてCD24の発現量と細胞の形態で解析してパネト細胞と幹細胞とを分けてソーティングし分離する。②分離したパネト細胞のクローニングによる株化と機能解析。得られたパネト細胞を限界希釈法にてクローニングし、株化が可能となる培養条件を検討し、培養が可能となったパネト細胞株のαディフェンシンの発現をsandwich ELISAと免疫組織化学法で解析する。③分離した腸管上皮幹細胞のパネト細胞への分化誘導法の検討。幹細胞の分離が成功した場合、各腸上皮構成細胞への分化誘導への関連が既に報告のあるWntやNotch等の分化に関連する分子をコントロールする蛋白や遺伝子を用いてパネト細胞への分化誘導が可能かどうかの検討を実施する。以上の結果、株化パネト細胞が得られた場合、口腔内細菌のマウス小腸上皮細胞、パネト細胞への影響の検討を順次実施する。
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| Causes of Carryover |
支払いは4月です。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
3月に執行済み。
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[Journal Article] Pr1E11, a novel anti-TROP-2 antibody isolated by adenovirus-based antibody screening, recognizes a unique epitope.2015
Author(s)
Ikeda M, Yamaguchi M, Kato K, Nakamura K, Shiina S, Ichikawa-Ando T, Misaka H, Myojo K, Nakamura K, Sugimoto Y, Hamada H.
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Journal Title
Biochem Biophys Res Commun
Volume: 458(4)
Pages: 877-882
DOI
Peer Reviewed
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