骨膜細胞の３次元構造のためのタンパク質間ネットワーク

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462986
• Research Institution: Osaka Dental University
• Principal Investigator: 秋山 真理 大阪歯科大学, 歯学部, 助教 (60340618)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 骨再生 / 骨膜細胞 / 質量分析

Outline of Annual Research Achievements

従来の研究で、ウシ骨膜細胞が培養シャーレ上で３次元構造を形成する際に発現するタンパク質を同定してきたが、タンパク質解析のサンプルに用いたのは培養上清であった。平成26年度から従来の培養上清ではなく、細胞質抽出液を用いて、質量分析によるタンパク質の解析を行った。培養上清を調べた時のコラーゲン以外のタンパク質の候補は、UACA、EXOSC9、TMX2、ベータ-チューブリン、F-box/LRR14などであり、のちに免疫染色によってこれらのタンパク質はすべてウシ骨膜細胞において発現していることを確認しているが、今回細胞質抽出液を用いて得られた候補タンパク質は数が少ないため、現在免疫染色によって確認中なのは、Rho GTPase activating protein 36 (ARHGAP36)のみである。従来調べていたタンパク質と異なり、ARHGAP36は細胞の核に発現しているのが特徴である。
ウシ骨膜細胞において発現している複数のタンパク質の発現部位と時期の違いを明らかにするため、従来は培養シャーレの上側、下側、関係なく細胞をごちゃまぜにして作製していたパラフィン切片を改良した。培養細胞のシャーレの底面に接する部分と培養液側にあたる部分をコラーゲンゲルで覆い（ちょうどどら焼きのような状態になる）、コラーゲンゲルにマーカーをつけて上下方向が見えるように切片を作製した。この改良法によって、培養シャーレのどの位置にどのタンパク質が発現しているのか特殊な装置を使わずに明らかにすることができる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成26年度は質量分析によって得られた情報が従来よりも少なかった。その理由は細胞質から採取できるタンパク質量が少ないため、何度も質量分析を行うことができず、質量分析を行っても強いシグナルが得られずに測定が失敗に終わったこともあるからである。
また、タンパク質の発現部位を明らかにするため、多層構造を形成している骨膜細胞の上にマーカーをつけようとして何度か失敗に終わったが、生体内の組織のように立体的な形をしているものと違い、培養シャーレ上の細胞は薄くて平べったい形をしているので、形を保ったまま、パラフィン切片を作製することが技術的に難しかったためである。

Strategy for Future Research Activity

骨膜細胞から細胞質抽出液を採取する際の方法を見直す。従来、抽出の際に、剪刀を用いて物理的に切断、試薬を用いて化学的に処理するなどの方法を行ってきたが、充分なタンパク質量が得られなかった。すり鉢を用いて細胞をすり潰すことで従来よりも多くのタンパク質を抽出できることがわかったので、今後はすり鉢を併用して研究を進める。
タンパク質の発現の部位を調べる研究では、コラーゲンゲルとマーカーを併用することで、細胞層の上下の位置がはっきりと見える切片の作製が可能であることがわかったので、今後も継続していく。