2015 Fiscal Year Research-status Report
プラズモンイメージングとサブ細胞レベル磁気分離によるオートファジーの理解
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26600053
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| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
前之園 信也 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 教授 (00323535)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | オートファジー / オートファゴソーム / プラズモンイメージング / 磁気分離 / 磁性体ナノ粒子 / ハイブリッドナノ粒子 / リポフェクション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オートファジーの機序の全容解明のための一つの重要な方法論として、オートファゴソームをリソソームと融合する前に単離し、オートファゴソーム形成に関わるタンパク質の同定や内部組成を直接分析するという、シンプルかつ直接的な手段が考えられる。しかし、過渡的に出現するオートファゴソームを単離することは難しく、密度勾配遠心などによる検討がされてはいるが、今のところ確実な方法は無く、革新的な単離技術の確立が期待されている。そこで本研究では、磁性とプラズモン特性を併有したデュアル機能ナノ粒子（ＤＦＮＰｓ）を創製し、オートファゴソームをリアルタイムでイメージングしながら磁場によってオートファゴソームを単離し、オートファゴソーム形成に関わるタンパクの同定や内容物の直接分析を可能にすることを目的としている。平成２７年度の研究実施計画は、ＤＦＮＰｓを哺乳動物細胞の細胞質へ送達し、プラズモン散乱イメージングする技術を確立することであったが、研究代表者らは、当初計画を大幅に前倒しして研究を進めることができた。平成２７年度の研究実績の具体的内容は次の通りである。
銀（Ａｇ）と鉄コバルト合金（ＦｅＣｏ）を複合化したＡｇ／ＦｅＣｏ／Ａｇコア／シェル／シェル型ＤＦＮＰｓを創製した。このＤＦＮＰｓは、超常磁性とプラズモン散乱特性という二つの異なる物理特性を兼ね備えており、オートファゴソームのイメージングと磁気分離が可能であることを確認した。このＤＦＮＰｓの表面を、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）骨格にラクトビオン酸（ＬＡ）とチオール基（ＳＨ）を導入したＰＬＬ－ＬＡ－ＳＨポリマーで修飾し、リポフェクション法によって哺乳培養細胞の細胞質へ送達したところ、ＤＦＮＰｓが再現性良くオートファゴソームへ取り込まれることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、平成２７年度はＤＦＮＰｓをリポフェクション法によって哺乳動物細胞の細胞質へ送達しイメージングするというところまでが達成目標であったが、幸運なことに当初の目標は早期に達成できたため、次の段階（当初は平成２８年度の計画にあった項目）、即ち、「実際にオートファジーを誘導し、オートファゴソーム内にＤＦＮＰｓを取り込ませ、プラズモンイメージングによってオートファゴソーム内へのＤＦＮＰｓの局在を確認する」というところまで到達したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２８年度は、以下の３つの目標を達成する。
（１）オートファゴソームの３次元構造解析：電子線トモグラフィー法により、ＤＦＮＰｓを取り込んだオートファゴソームの３次元精密構造解析を行う。
（２）オートファゴソームの磁気分離：ＤＦＮＰｓを哺乳培養細胞の細胞質に送達し、プラズモン散乱によるライブイメージングを行いながら、オートファゴソームにＤＦＮＰｓが取り込まれたことを確認後、細胞膜のみを温和に破砕し、オートファゴソームを磁気分離する。
（３）プロテオーム解析：単離したオートファゴソームをプロテオーム解析に供し、タンパク質のプロファイリングを行う。
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Research Products
(12 results)
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[Presentation] Magnetic-Plasmonic Hybrid Ag@FeCo@Ag Core@Shell@Shell Nanoprobes for Isolation of Intracellular Membrane Vesicles2015
Author(s)
M. Takahashi, P. Mohan, K. Higashimine, A. Nakade, D. Mott, T. Hamada, K. Matsumura, T. Taguchi, and S. Maenosono
Organizer
PACIFICHEM 2015
Place of Presentation
Honolulu, Hawaii, USA
Year and Date
2015-12-15 – 2015-12-20
Int'l Joint Research
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