2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26650039
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
横山 謙 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (70271377)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | V-ATPase / ATP synthase / proton pump / molecular motor / rotation |
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| Outline of Annual Research Achievements |
VoV1 は、ATPを分解して得られる回転力を膜内在性のVo部分にある回転子（ローターリング）に伝え回転させることでプロトンを輸送する。V1部分で３分子の ATPを分解すると、回転子が一回転することから、ATP１分子の分解で輸送されるプロトンの数 (proton/ATP ratio, P/A 比)は、ローターリングにあるプロトン結合部位の３分の１と予想される。これは、V1 と Vo 間のエネルギー共役が ‘tight’ であることが前提である。しかしながら VoV1 のプロトン輸送活性の実測値がないことから、実験値に基づくP/A 比は不明であった。
本研究では、極微小体積のチャンバー上に貼った脂質二重膜上に VoV1 を再構成し、チャンバー内に閉じ込めた pH 指示薬の蛍光強度変化を測定することで１分子 VoV1 のプロトン輸送活性の測定を試みた。ATP依存的な蛍光強度変化は観察されたものの、プロトン輸送活性に換算すると非常に低く、P/A 比は理論値である 4 に比べ低くなった。これは、チャンバーと膜との密閉性が低く、プロトンのリークがあることが原因と考えられる。
そこで、リポソームに VoV1 を再構成し、リポソームを構成する脂質分子に蛍光指示薬である pHrode を結合させた系を用いてプロトンポンプ活性を測定した。この系では溶液中に蛍光指示薬がなくバックグランドの蛍光を低くすることができる。さらに、直径が揃ったリポソームを作成すること、緩衝液や酵素によるpH変化に対する緩衝能を見積もった理論式を使うことで、プロトン輸送速度を見積もった。その結果、概ね P/A 比は 3-4 の間になった。初めて 実験的に求められた VoV1 の P/A 比であり、この結果、V1 と Vo 間のエネルギー共役が tight であることが実験的に示された。
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Research Products
(6 results)
