2014 Fiscal Year Research-status Report
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26660166
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
井上 晶 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 准教授 (70396307)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
尾島 孝男 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 教授 (30160865)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | モータータンパク質 / ミオシン / アクチン / 褐藻類 / コンブ類 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、褐藻類マコンブに見出された特異な構造をもつミオシン様タンパク質LjM004の構造機能連関および褐藻類における分布を調べることにより、同タンパク質の生理学的意義を解明するものである。
大腸菌を用いて組換えLjM004（rLjM004）を生産し、F-アクチンおよびATP存在下における挙動を調べた結果、LjM004はATPの有無に関わらずF-アクチンと結合することを共沈法により明らかにした。また、rLjM004をガラス板上に固定化し、蛍光アクチンを用いて顕微鏡下での観察を行った。ATPが存在しない場合にはアクチンは個々の線維状態を維持したままrLjM004に結合した。そこにATPを加えても一部のアクチンは解離したが、大部分のアクチンはATP添加前と変化が無かった。一方、ATPとF-アクチンを同時に加えた場合にはアクチンが束化する様子が観察された。さらにアクチンの束化は、外部からrLjM004を加えることにより促進されることが分かった。rLjM004によるアクチンの束化の至適塩濃度は、50-150 mM NaClであり、300 mM以上の塩濃度下では束化は全く観察されなかった。
LjM004に存在するユニークな領域であるC末端の23アミノ酸を切断した変異体についても上記と同様の方法で発現し、その機能を調べた。その結果、同変異体はF-アクチンに結合能をもつものの束化能を示さなかったことから、C末端部の同領域がアクチンの束化に必須であることが分かった。
また、rLjM004の分子形状について電子顕微鏡を用いて調べた。rLjM004は単量体として存在し、顕微鏡下では球状のタンパク質として観察された。
以上の結果から、LjM004は少なくとも2箇所のアクチン結合部位をもつと予測され、これらはATP依存的および非依存的にそれぞれアクチンと結合するものと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は概ね研究計画を遂行できたが、本研究を進める中でいくつかの問題点が生じ、一部の予定していた実験については検討できなかった。ひとつはLjM004のATP分解能に関する実験が完了しなかった点である。本タンパク質はATP分解能をもたない、あるいはほとんど示さないことから、その性状を詳細に調べるには多くの組換えタンパク質を必要とするが、構築したタンパク質発現系によって得られる組換えタンパク質量が少なく困難であった。また、変異体タンパク質を用いた実験では、N末端の65アミノ酸を切断した変異体が可溶性タンパク質として発現できなかったため、LjM004のN末端部分の機能を解明することができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も引き続き現在使用している大腸菌発現系を用いて、LjM004の生化学的性状の解析について進める予定であるが、より多くの組換えタンパク質を得ることを目的として昆虫細胞などの他種細胞発現系の利用についても検討する。また、他種の褐藻類における相同タンパク質の分布についても遺伝子レベルで調べ、相同タンパク質が見出された場合にはLjM004と同等の機能をもつか否かについても検討し、ユニークな構造をもつ本タンパク質の褐藻類細胞内における機能と生理学的意義を解明する。
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