2016 Fiscal Year Annual Research Report
Polarized fluorescence microscopy analysis of nuclear lamina
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26670087
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
佐藤 啓介 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60644044)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
寺田 純雄 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (00262022)
川岸 将彦 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60323606)
齊藤 健太 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60374659)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 蛍光偏光 / ラミン / 細胞分裂 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までで、LaminAおよびLaminAに対するconstrained taggingが終了したことを受け、今年度はCRISPR/Cas9法による安定発現株の作製作りを中心に進めた。また、蛍光異方性の向きとラミンフィラメントの方向との相関を調べるため、精製タンパク質を用いたin vitroでのラミンフィラメントの再構成を行った。
１．LaminB1：平成27年度にHEK293細胞を親株として作製した、蛍光異方性を有するLaminB1-EGFP安定発現株を用いて蛍光異方性観察を試みたが、協力研究者である谷博士の観察システムとの相性が悪く、データ取得に至らなかった。そのため、親細胞株をHeLa細胞に変更して再度安定発現株の作製を目指した。その際、CIRSPR/Cas9法に用いるgRNA配列を再検討し、より効率よく切断するものに変更した。現在、HDR（homology-directed recombination）用のコンストラクトを作製中である。
２．LaminA：平成27年度に新たに作製した蛍光異方性を有するLaminA-EGFPコンストラクトについて、HeLa細胞を親株に、CRISPR/Cas9法により安定発現株を作製し、5コンストラクトにつきそれぞれ十株程度の候補を得ている。現在、TIRF顕微鏡観察により、蛍光異方性解析に適した株をスクリーニングしているところである。
３．in vitro蛍光ラミンフィラメントの再構成：蛍光偏光の向きとラミンフィラメントの対応をつけるために、大腸菌でEGFP融合LaminAおよびLaminB1を発現・精製し、in vitroでフィラメントの作製を試みた。申請者による実験ではフィラメントが作製できたが、共同研究者の谷博士の実験室では再現できていないため、より再現しやすいフィラメント形成条件を探っている。
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