高速分子動力学法によるHCV抗ウイルス薬耐性化予測仮想アッセイシステムの構築

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26670375
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 坂本 直哉 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10334418)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 遠藤 俊徳 北海道大学, 情報科学研究科, 教授 (00323692) ; 須田 剛生 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), その他 (20447460)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 分子動力学シミュレーション / C型肝炎 / 抗ウイルス療法 / 薬剤耐性変異

Outline of Annual Research Achievements

我々は、分子動力学解析法により、HCVを標的としたDirect acting antiviralsとそれぞれの標的蛋白との動的結合モデルを構築し、ウイルス薬剤耐性変異が標的結合性、複合体安定性に与える影響を解析、さらに得られた結果を、標的蛋白に変異を導入したHCV replicon細胞を用いた増殖・薬剤耐性レベルの解析で確認することを目的として研究を遂行し以下の結果を得た。
(1) HCV-NS5A蛋白は小胞体局在蛋白であり細胞内では二量体として存在する。NS5A蛋白とNS5A阻害薬分子、小胞体核酸、DAA分子のモデリングと分子動力学シミュレーションを実施し、NS5A2量体が安定して小胞体膜上に局在するための最適構造を確定した。
(2) 未だ正確な結合構造があきらかにされていないNS5A阻害薬DaclatasvirとNS5A2量体の結合構造をシミュレーションしたところ、薬剤耐性変異L31, Y93アミノ酸残基の近傍に結合が安定化することを確認した。
(3) 分子動力学シミュレーションで得られた仮説(モデル)を検証するためにNS5A阻害薬に対する耐性変異を有するHCV repliconおよびHCV genotype 1b培養系を構築し、増殖能および薬剤感受性を解析し、シミュレーションでの結合安定性と薬剤感受性が逆相関することが確認された。
本研究の成果により、今後数多く導入されるDAAプロトコルの症例に応じた適切な選択と適用決定のためのエビデンスを構築できる。また、ウイルス標的蛋白の遺伝情報のみから、治療効果、薬剤感受性、さらに治療による薬剤耐性化をin-silicoでウイルス培養を行うことなく解析、予測する仮想検査システムを構築することが可能となる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度の研究計画である分子シミュレーションモデルの構築と薬剤耐性変異のin silicoおよびin vitro治験の関連づけに関して概ね計画通りに遂行できている。

Strategy for Future Research Activity

来年度は、(1)NS5A蛋白二量体およびNS5A蛋白-NS5A阻害薬複合体の細胞内における動態、相互の分子間相互作用、およびアミノ酸変異存在時の変化を予測するため、分子動力学シミュレーションを下記の手順で施行する。
i.変異導入により、タンパク-Daclatasvir のaffinity 低下を確認する。
ii.変異導入により、Daclatasvirが結合していたサイトを物理的に埋め、静電的にも結合に不利な状況になることを確認する。
iii.シミュレーションと実験について:シミュレーションを行うにあたって必要なインプットに関する実験、もしくは NMR による共結晶の構造、結合領域の特定などを予備的に施行する。さらに(2)分子動力学シミュレーションにより同定した耐性変異のin vivoでの機能、薬剤感受性を検証するため、ヒト肝細胞移植Alb-uPA/SCIDマウスにウイルス血清を接種し、薬剤投与後経時的に血中HCV-RNA量および標的タンパクの変異出現を解析する。

Causes of Carryover

平成26年度未使用額の発生理由：平成26年度前半にはin silicoによる分子動力学シミュレーション解析によるデータ収集を主に遂行した。培養細胞系を用いたin vitro検証実験は上記の結果を基に行う予定としていたが、薬剤耐性変異の候補が少なかったため、検証実験のための試薬の使用が予想より少なかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

上記の世理由により当該年度の試薬、消耗品の未使用分は、平成27年度研究計画遂行のための試薬、消耗品購入に使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Serum granulysin levels as a predictor of serious telaprevir-induced dermatological reactions. (2015)
  • Author(s): Suda G, Yamamoto Y, Nagasaka A, Furuya K, Kudo M, Chuganji Y, Tsukuda Y, Tsunematsu S, Sato F, Terasita K, Nakai M, Horimoto H, Sho T, Natsuizaka M, Ogawa K, Ohnishi S, Chuma M, Fujita Y, Abe R, Taniguchi M, Nakagawa M, Asahina Y, Sakamoto N
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1111/hepr.12421
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] New molecularly targeted therapies against advanced hepatocellular carcinoma: From molecular pathogenesis to clinical trials and future directions. (2015)
  • Author(s): Chuma M, Terashita K, Sakamoto N
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1111/hepr.12459
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Genome-wide association study identifies a PSMD3 variant associated with neutropenia in interferon-based therapy for chronic hepatitis C. (2015)
  • Author(s): Iio E, Matsuura K, Nishida N, Maekawa S, Enomoto N, Nakagawa M, Sakamoto N, Yatsuhashi H, Kurosaki M, Izumi N, Hiasa Y, Masaki N, Ide T, Hino K, Tamori A, Honda M, Kaneko S, Mochida S, Nomura H, Nishiguchi S et al.
  • Journal Title: Hum Genet Volume: 134 Pages: 279-289
  • DOI: 10.1007/s00439-014-1520-7
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Impaired induction of IL28B and expression of IFNλ4 associated with non-response to interferon-based therapy in chronic hepatitis C. (2015)
  • Author(s): Murakawa M, Asahina Y, Nakagawa M, Sakamoto N, Nitta S, Kusano-Kitazume A, Watanabe T, Kawai-Kitahata F, Otani S, Taniguchi M, Goto F, Nishimura-Sakurai Y, Itsui Y, Azuma S, Kakinuma S, Watanabe M
  • Journal Title: J Gastroenterol Hepatol Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1111/jgh.12902
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Ledipasvir and sofosbuvir fixed-dose combination with and without ribavirin for 12 weeks in treatment-naive and previously treated Japanese patients with genotype 1 hepatitis C: an open-label, randomised, phase 3 trial. (2015)
  • Author(s): Mizokami M, Yokosuka O, Takehara T, Sakamoto N, Korenaga M, Mochizuki H, Nakane K, Enomoto H, Ikeda F, Yanase M, Toyoda H, Genda T, Umemura T, Yatsuhashi H, Ide T, Toda N, Nirei K, Ueno Y, Nishigaki Y et al.
  • Journal Title: Lancet Infect Dis Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1016/S1473-3099(15)70099-X
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ITPA genetic variants influence efficacy of PEG-IFN/RBV therapy in older patients infected with HCV genotype 1 and favourable IL28B type. (2014)
  • Author(s): Matsuura K, Tanaka Y, Watanabe T, Fujiwara K, Orito E, Kurosaki M, Izumi N, Sakamoto N, Enomoto N, Yatsuhashi H, Kusakabe A, Shinkai N, Nojiri S, Joh T, Mizokami M
  • Journal Title: J Viral Hepat Volume: 21 Pages: 466-474
  • DOI: 10.1111/jvh.12171
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The J6JFH1 strain of hepatitis C virus infects human B-cells with low replication efficacy. (2014)
  • Author(s): Nakai M, Seya T, Matsumoto M, Shimotohno K, Sakamoto N, Aly HH
  • Journal Title: Viral Immunol Volume: 27 Pages: 285-294
  • DOI: 10.1089/vim.2013.0140
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Sofosbuvir plus ribavirin in Japanese patients with chronic genotype 2 HCV infection: an open-label, phase 3 trial. (2014)
  • Author(s): Omata M, Nishiguchi S, Ueno Y, Mochizuki H, Izumi N, Ikeda F, Toyoda H, Yokosuka O, Nirei K, Genda T, Umemura T, Takehara T, Sakamoto N, Nishigaki Y, Nakane K, Toda N, Ide T, Yanase M, Hino K et al.
  • Journal Title: J Viral Hepat Volume: 21 Pages: 762-768
  • DOI: 10.1111/jvh.12312
  • Peer Reviewed