2015 Fiscal Year Annual Research Report
コンディショナルノックアウト技術を用いた不完全変態昆虫の翅形成メカニズムの解明
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26870415
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
渡辺 崇人 徳島大学, 農工商連携センター, 特任助教 (30709481)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ノックイン / コンディショナルノックアウト / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
フタホシコオロギではこれまでにCRISPR/Cas9システムを用いて，標的ゲノム領域へ特異的に変異を導入することに成功している。標的遺伝子を時間・空間特異的にックアウトするためには，対応するシス調節領域を破壊する必要があるが，標的遺伝子の配列が長い場合やシス調節領域の特定が困難である場合が多く，単純な変異導入ではコンディショナルノックアウト系統を作製することはできない。そこで，ゲノム中からシス調節領域を大きく抜き出す実験系の確立を試みた。標的にはactin遺伝子を用いてショウジョウバエの報告を参考として実験を行ったところ，標的配列をゲノム上から抜き出すことには成功したものの，効率は大変低く実用性はなかった。
そこで，新たにノックイン技術を応用したコンディショナルノックアウト法を考案した。ノックイン技術に関してはゼブラフィッシュの報告を参考とし，非相同末端結合によるノックインを試みた。条件検討の結果，フタホシコオロギにおいて初めてノックインに成功し，マーカー遺伝子をゲノムに組み込むことができた。このノックイン技術を用いてコオロギのHOX遺伝子であるabd-A, UbxにGFP遺伝子を組み込み，これらの遺伝子の発現をリアルタイムイメージングすることに成功した。
現在，コンディショナルノックアウト実現のためにpiggyBacのコンポーネントが組み込まれたノックインベクターを作製し，コオロギゲノムへ導入しているところである。
また，これまでHiseqを用いてゲノム解析を進めてきたが，コオロギにおいては発生に関わる遺伝子の5’側がGCリッチであることが多く，配列が明らかではない遺伝子も多い。そこで，新たにlong readの次世代シークエンサーのPacBio RSIIを用いてゲノム解析を進めている。これまでにシークエンスデータは得られており，現在Gap closing解析を行っている。
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[Journal Article] Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.2015
Author(s)
Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M.
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 5
Pages: 15885
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.2015
Author(s)
Matsuoka, Y., Bando, T., Watanabe,T., Ishimaru, Y., Noji, S., Popadic, A., Mito,T.
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Journal Title
Biology Open
Volume: 4
Pages: 702-709
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] Genome sequencing and annotation of the cricket Gryllus bimaculatus, a hemimetabolous insect model.2015
Author(s)
Mito, T., Itoh, T., Mirimoto, H., Kijitani, R., Toyoda, A., Tomonari, S., Fuketa, M., Watanabe, T., Matsuoka, Y.
Organizer
9th Annual Arthropod Genomics SYMPOSIUM
Place of Presentation
Kansas, USA
Year and Date
2015-06-17 – 2015-06-19
Int'l Joint Research
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[Presentation] Genome editing in the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus, using CRISPR/Cas9 system.2015
Author(s)
Watanabe, T., Matsuoka, Y., Tomonari, S., Kurita, C., Noji, S., Mito, T.
Organizer
Insect Genetic Technologies WORKSHOP
Place of Presentation
Kansas, USA
Year and Date
2015-06-17 – 2015-06-17
Int'l Joint Research
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[Presentation] Functional analysis of a Hox gene, abdominal-A, using CRISPR/Cas9 system in the cricket Gryllus bimaculatus2015
Author(s)
Matsuoka, Y., Watanabe, T., Kurita, C., Tomonari, S., Noji, S., Mito, T.
Organizer
第４８回日本発生生物学会年会
Place of Presentation
つくば国際会議場（茨城県つくば市）
Year and Date
2015-06-02 – 2015-06-05
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