2015 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of molecular basis regulation mechanism for serine biosynthesis in plant
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26870855
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
岡村 英治 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 特別研究員 (90604398)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Plant / Arabidopsis / Serine / Allosteric |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、植物のL-serine生合成を担うリン酸化経路とその代謝制御機構における分子基盤解明を目的とする。以下、平成27年度の研究内容と結果及び進行状況について報告する。
研究内容; (1) 代謝制御の鍵酵素3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ (PGDH) の活性制御機構解明, (2) シロイヌナズナにおけるPGDH遺伝子変異株を用いたフィードバック制御機構の生理学的役割の解明
結果及び進行状況; (1) シロイヌナズナ由来PGDHアイソザイム (AtPGDH1、AtPGDH2及びAtPGDH3) の変異酵素に関して詳細な解析を行った。2種類のキメラ酵素 (アミノ酸による制御を受けるAtPGDH1及び制御を受けないAtPGDH2のC末端を交換した変異酵素) に対して、昨年度明らかにしたエフェクターアミノ酸の影響をヒルの式によって解析した。その結果、L-serineによる協奏的な活性阻害は、PGDHのC末端のみに依存することを明らかにした。また、L-valineやL-homoserineに関しても同様の結果を得たが、活性促進の最大効果は野生型酵素よりも大幅に低下した。一方、L-homocysteine、L-alanine及びL-methionineによる活性促進は、その最大効果が野生型酵素よりも大幅に低下したものの、C末端のみならずN末端も寄与することを明らかにした。(2) 昨年度構築したAtPGDH2とAtPGDH3のホモノックアウト株の掛け合わせを行い、二重変異株を構築した。現在ジェノタイピングによる選抜を行っている。一方、ホモノックアウト株が胚性致死となるAtPGDH1の変異株については、シロイヌナズナの内在性マイクロRNAによる発現抑制株の取得が報告されたため、同様の発現抑制株構築を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究内容(1)に関して、シロイヌナズナ由来PGDHの生化学実験は、当初目的とした以上の解析結果を取得することができた。平成27年度に、がん細胞由来PGDHに関して、その基質特異性に関する新しい知見が報告された。本研究では当初予定していなかったものの、シロイヌナズナ由来PGDHに関して基質特異性を調べた。結果、がん細胞由来PGDHとは異なり、その基質特異性は極めて厳密であることを明らかにした。従って、シロイヌナズナ由来PGDHの生化学実験に関しては、当初予定していたよりも大幅に成果を上げることができたと考える。またイネ由来PGDHに関しては、すでに基本的な酵素学的諸性質 (ミカエリス定数や最大反応速度、至適pHなど) やアミノ酸添加による影響は解析が終了しており、今後、ヒルの式による解析を行う。ヒメツリガネゴケやオオムギに関しては、現在、発現系の構築を行っており、本年度中に一連の生化学実験を完了させる予定である。一方、研究内容(2)に関しては、当初リン酸化経路に関わる遺伝子群の細胞内局在解析を予定していたが、これらの知見に関しては、すでに既報となった。従って、PGDH遺伝子変異株の作成に注力することにした。遺伝子破壊株及び遺伝子発現抑制株に関しては順調に構築が完了しており、本年度中にこれらは破壊株や発現抑制株を用いたキメラ遺伝子(研究内容1の生化学実験において取得した結果)による相補実験が完了する予定である。以上の状況を総括して、研究計画の変更を伴ったものの、おおむね順調に進展していると評価する。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究内容 (1) に関する生化学実験では、シアノバクテリア (Synechocystis sp. PCC 6803) 由来PGDHに関しても実験を行う予定であった。これまでシャペロン共発現系などにより、組換えタンパク質の可溶化を試みたものの、未だ可溶化できていない。そこで、すでに可溶化することが報告されている耐塩性シアノバクテリアとして知られるAphanothece halophytica由来PGDHの組換えタンパク質を取得することも検討している (遺伝子配列の取得は遺伝子全合成により対応)。ただし、<i>Synechocystis</i> sp. PCC 6803由来PGDHに関しても継続して可溶化条件の検討を行う。イネやオオムギ、ヒメツリガネゴケ由来PGDHの生化学実験の内容に関しては、現時点では計画の変更なく遂行する予定である。一方、研究内容 (2) に関しては、リン酸化経路遺伝子群の細胞内局在解析はすでに既報となった。このため遺伝子変異株を用いたフィードバック制御機構の生理学的役割の解明に注力することにした。現時点で、すべてのアイソザイムの遺伝子破壊株もしくは遺伝子発現抑制株の一重変異体の構築が完了している。これら一重変異株を研究内容 (1) で得られたキメラ酵素の遺伝子で相補し、形質の変化や代謝産物の経時的変化を解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
当初予定していた出張計画の変更、並びに論文出版計画の変更が、次年度使用額が生じた理由である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
論文出版に伴う英文校閲費用などに組み入れて使用する予定である。
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