蛋白質工学的手法を活用した微生物起源の蛋白性プロテアーゼインヒビターの多角的研究

1988 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 62300011
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 廣海 啓太郎 京都大学, 農学部, 教授 (50025425)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 赤坂 一之 京都大学, 理学部, 助教授 (50025368) ; 三井 幸雄 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (40012637) ; 太田 隆久 東京大学, 農学部, 教授 (30011844) ; 三浦 謹一郎 東京大学, 工学部, 教授 (30000227) ; 石井 信一 北海道大学, 薬学部, 教授 (90001031)
• Keywords: 蛋白質工学 / 遺伝子工学 / プロテアーゼインヒビター / ズブチリシンインヒビター / 金属プロテアーゼインヒビター / 蛋白質の核磁気共鳴 / 蛋白質のX線結晶解析 / 酵素-インヒビター相互作用

Research Abstract

本報告中では、SSIは「放線菌のズブチリシンインヒビター」を、SMPIは「放線菌の金属プロテアーゼインヒビター」を表す。放線菌の金属プロテアーゼSGMPA及びSGMPBの高感度活性測定用発蛍光性基質を開発し、これを用いてSSIの両酵素に対する阻害物質定数を精度良く求めた(石井)。遺伝子工学的手法を用いて、SSIのP1及びP4位置のMetを種々の他のアミノ酸に置換することに成功し、これら変異種の酵素阻害活性を測定した(三浦)。SSIに対するモノクローナル抗体の作成を試み、5種のIgG1産生クローンを確立し、NMRによる構造解析を行った(荒田)。シンクロトロン放射光を用いて、SSI・ズブチリシン複合体結晶の1.85〓分解能のX線回折データの収集に成功し、これに基づく構造精密化を行った(三井)。耐熱性プロテアーゼ、アクアライシンIの基質特異性を31種のSuc-トリペプチド-pNAを基質として検討した(太田)。クローン化した遺伝子を用いるSMPIの生産において、菌体外分泌生産量を増大する条件を検討した(高橋)。組替えDNA法を用いた位置特異的アミノ酸置換によるSSIの構造変化を、安定同位体置換法によるNMRにより詳細に解析した(甲斐荘)。人工変異SSIにつき重水素NMRによる観測を行い分子構造の「ゆらぎ」を解析した(赤坂)。SMPI及び人工変異SSIと酵素との相互作用を分光学的手段等を用いて解析した(廣海・外村)。海洋細菌から分子量約2万の糖蛋白であるチオールプロテアーゼインヒビターを精製した(池中)。ペプスタチン非感受性の新酸性プロテアーゼを強く阻害するペプチド性インヒビターを単離し、その構造を決定した(小田)。好熱菌に発見した新規な酸性プロテアーゼは酸化インシュリンB鎖のLeu15-Tyr16を特異的に水解することを明らかにした。このものはSSIを限定加水分解する(村尾)。

Research Products

• [Publications] MIURA,Kin-ichiro.: Proc.Jpn.Acad.Sci.64B. 147-149 (1988)
• [Publications] MATSUZAWA,Hiroshi.: Eur.J.Biochem.171. 441-447 (1988)
• [Publications] KWON,Suk-Tae.: Eur.J.Biochem.173. 491-497 (1988)
• [Publications] KWON,Suk-Tae.: J.Biochem.104. 557-559 (1988)
• [Publications] TAKEUCHI,Yasuo.: KEK Report(Project No.88-047). (1988)
• [Publications] MORINO,Tomio.: Appl.Microbiol.Biotech.27. 517-520 (1988)
• [Publications] TANAKA,K.: Biochem.Biophys.Res.Comm.155. 487-492 (1988)
• [Publications] NAGASO,Hiroshi.: J.Bacteriol.170. 4451-1157 (1988)
• [Publications] WESTLER,W.M.: J.Amer.Chem.Soc.110. 6256-6258 (1988)
• [Publications] WESTLER,W.M.: J.Amer.Chem.Soc.110. 4093-4095 (1988)
• [Publications] ODA,Kouhei.: Agric.Biol.Chem.53. 405-415 (1989)
• [Publications] MURAO,Sawao.: Agric.Biol.Chem.
• [Publications] 石井信一: 日本農芸化学会誌. 62. 1810-1814 (1988)
• [Publications] 矢田信久: 生化学. 60. 878 (1988)
• [Publications] 田村厚夫: 生化学. 60. 738 (1988)
• [Publications] 西山佳孝: 生化学. 60. 738 (1988)
• [Publications] 小島修一: 生化学. 60. 738 (1988)
• [Publications] 三井幸雄: 学術月報. 41. 724-730 (1988)
• [Publications] 甲斐荘正恒: 日本農芸化学会誌. 62. 1822-1827 (1988)
• [Publications] 外村辨一郎: 日本農芸化学会誌. 62. 1814-1817 (1988)
• [Publications] 赤坂一之: 日本農芸化学会誌. 62. 1818-1822 (1989)
• [Publications] 藤谷靖志: 日本農芸化学会誌. 63No.3. 300 (1989)
• [Publications] 門間敬子: 日本農芸化学会誌. 63No.3. 301 (1989)